Abstract
Minskad ryggmärgs blodflöde (SCBF) (dvs, ischemi) spelar en nyckelroll i traumatisk ryggmärgsskada (SCI) patofysiologi och är därför ett viktigt mål för neuroprotektiva terapier. Även om flera tekniker har beskrivits för att utvärdera SCBF, de alla har betydande begränsningar. För att övervinna det senare, föreslår vi användning av realtids-kontrastförstärkt ultraljud (CEU). Här beskriver vi tillämpningen av denna teknik i en rått kontusion modell av SCI. En jugular kateter implanteras först för upprepad injicering av kontrastmedel, en natriumkloridlösning svavelhexafluorid inkapslade mikrobubblor. Ryggraden är sedan stabiliseras med en skräddarsydd 3D-ram och ryggmärgen dura mater exponeras genom en laminektomi vid ThIX-ThXII. Ultraljudssonden positioneras sedan vid den bakre sidan av dura mäter (belagd med ultraljudsgel). För att bedöma baslinjen SCBF, en enda intravenös injektion (400 l) av contrast Medlet appliceras för att registrera dess passage genom den intakta ryggmärgen mikrovaskulatur. En vikt-släpp anordning används därefter för att generera en reproducerbar experimentell kontusion modell av SCI. Kontrastmedlet återinjiceras 15 minuter efter skadan för att bedöma efter SCI SCBF förändringar. CEU möjliggör realtid och in vivo bedömning av SCBF förändringar efter SCI. I den oskadade djur, ultraljud visade ojämn blodflödet längs den intakta ryggmärgen. Vidare, 15 min efter SCI, det var kritisk ischemi i nivå med epicentrum medan SCBF förblev bevarade i de mer avlägsna intakta områden. I de regioner som gränsar till epicentrum (både rostralt och caudal), var SCBF minskas betydligt. Detta motsvarar den tidigare beskrivna "ischemisk Penumbra zon". Detta verktyg är av stort intresse för att bedöma effekterna av behandlingar som syftar till att begränsa ischemi och den resulterande vävnadsnekros efter SCI.
Introduction
Traumatisk ryggmärgsskada (SCI) är en förödande tillstånd vilket leder till betydande försämring i motor, sensoriska och autonoma funktioner. Hittills har ingen terapi visat sig vara effektiv hos patienter. För en sådan anledning, är det viktigt att identifiera nya tekniker som kommer att förbättra bedömningen av potentiella behandlingar och kan ytterligare belyser skada pathiophysiology 1.
SCI är uppdelad i två på varandra följande faser, kallade primära och sekundära skador. Den primära skadan motsvarar den initiala mekaniska förolämpning. De sekundära skadegrupperna en kaskad av olika biologiska händelser (såsom inflammation, oxidativ stress och hypoxi) som ytterligare bidrar till den progressiva expansionen av den ursprungliga skadan, vävnadsskada och därför neurologiska underskott 2,3.
Vid den akuta fasen av SCI är neuroprotektiva behandlingar syftar till att minska sekundära skador patologi och shOuld följaktligen förbättra neurologiska utfall. Bland de många sekundära skadehändelser, spelar ischemi en avgörande roll 4,5. På nivån för SCI epicentrum, de skadade parenkyma mikrokärl hämma en effektiv ryggmärgen blodflöde (SCBF). Dessutom är SCBF minskade också signifikant i den region som omger skadan epicentrum, ett område som särskilt kallas "ischemisk Penumbra zon". Om SCBF inte kan snabbt återställas inom dessa områden, kan ischemi leda till kompletterande parenkymal nekros och ytterligare nervvävnadsskada. Som även den minsta vävnads bevarande kan få betydande effekter på funktion, är det av stort intresse att utveckla läkemedel och behandlingar som kan minska ischemi efter SCI. För att belysa detta fenomen har tidigare arbete visat att bevarandet av endast 10% av myeliniserade axoner var tillräckligt för att möjliggöra promenader i katter efter SCI 6.
Även om flera tekniker har beskrivits för att utvärdera SCBF, deny alla har betydande begränsningar. Till exempel användning av radioaktiva mikrosfärer 7,8 och C14-iodopyrine autoradiografi 9 kräver efterföljande djuroffer och kan inte upprepas vid senare tidpunkter. Clearance vätetekniken 10 beror på införing av intraspinala elektroder, vilket ytterligare kan skada ryggmärgen. Även laser Doppler imaging, fotopletysmografi 14,15 och in vivo ljusmikroskop 16 har ett mycket begränsat djup / område för mätning 11-13.
Vårt team har tidigare visat att kontrastförstärkt ultraljud (CEU) avbildning kan användas för att bedöma realtid och in-vivo SCBF förändringar i rått ryggmärgen parenkymet 17. Det är viktigt att notera att en liknande teknik anbringades av Huang et al., I en grismodell av SCI 18. CEU tillämpar ett bestämt sätt att ultraljudsundersökningar som gör det möjligt att koppla gråskala morfologiska imåldrar (som erhållits genom konventionella B-läge) med geografiska fördelningen av blodflödet 19. Den SCBF avbildning och kvantifiering bygger på intravaskulär injektion av eko-kontrastmedel. Kontrastmedlet består av svavelhexafluorid mikrobubblor (medeldiameter av ca 2,5 ^ m och 90% har en diameter mindre än 6 pm) stabiliseras genom fosfolipider. Mikrobubblorna speglar ultraljudstrålen som avges av sonden förstärker därmed blodets ekosignaler och ökar kontrasten i vävnaderna i enlighet med deras blodflöde. Det är därför möjligt att bedöma blodflödet i en viss region av intresse i enlighet med intensiteten hos den reflekterade signalen. Mikrobubblorna är också säkra och de har kliniskt tillämpats i människa. Den svavelhexafluorid snabbt rensas (genomsnittlig terminal halveringstid är 12 minuter) och mer än 80% av den administrerade svavelhexafluorid återfinns i utandningsluften inom 2 minuter efter injektionen. Detta protokoll ger ett enkelt sätt att använda CEU imaging att bedöma SCBF förändringar hos råtta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: De metoder som beskrivs i detta manuskript har godkänts av bioetiska kommitté av Lariboisière School of Medicine, Paris, Frankrike (CEEALV / 2011-08-01).
1. Instrument Framställning
- Förbered och rengör följande instrument för katetrar: mikro pincett, mikro-sax, mikro-vaskulär klämma, stora saxar, kirurgisk tråd (svart flätat silke 4-0) och en 14 G kateter. Heparinisera katetern med en heparinlösning (5000 U / ml).
- Förbered och rengör följande instrument för laminektomi: stora saxar, skalpell och ett ben cutter. Utför laminektomi med en skräddarsydd ben cutter som syftar till att minska risken för att skada ryggmärgen under laminektomi (Figur 1).
- Set-up 3D-ram som används för positionering och stabilisering av djuret. Den skräddarsydda ram är byggd med inslag av en extern fixa Hoffman 3 i förening med pincett, which har krökt för att passa den lumbala ryggraden av djuret.
- Förbered vikt-släpp-enhet (kroppen) används för ryggmärgen biomekanisk skada.
OBS! Skräddarsydd impac enhet har utformats med en 3D-programvara och skrivs ut i 3D. - Slå på ultraljud maskin.
- Förbered kit för beredning av kontrastmedlet.
OBS: I satsen ingår 1 flaska innehållande 25 mg frystorkat pulver, 1 förfylld spruta med 5 ml natriumklorid och en mini-spik överföra systemet (Figur 2). Stegen för beredning av kontrastmedlet beskrivs nedan (i avsnitt 5).
2. halsvenen Kateterisering (Figur 3)
- Söva djuret med 4% isofluran. Placera djuret i ryggläge. Bekräfta korrekt anesthetization genom att säkerställa att djuret inte svarar när tassarna kläms med en pincett. Applicera veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet samtidigt undER anestesi.
- Raka halsen och rengör huden. Gör ett snitt på mittlinjen av halsen. Kör sternocleidomastoidian muskeln för att hitta den inre halsvenen. Dra en ligatur på rostralt delen av venen.
- Applicera en mikrovaskulär klämma på venen, 1 cm under ligatur. Passera en annan tråd runt venen, strax under klämman med knuten redo att skärpa när klämman släpps.
- Öppna väggen i venen (venotomi) mellan klämman och den rostrala ligaturen. Inför en 14 G kateter i lumen av venen och tryck den mot hjärtat.
- När det kommer upp mot klämman släpper senare och tryck katetern vidare. Säkra katetern i venen, genom att bestämt dra åt knut på venen med katetern inuti.
- Utvärdera öppenheten hos katetern genom att dra tillbaka en liten mängd av venöst blod i katetern och därefter sedan spola den med hepariniserad saltlösning. Detta förhindrar tilltäppning över catheter av en potentiell blodpropp.
- Anslut böjlig slang till katetern för ytterligare injektion av kontrastmedel (mikrobubblor). Håll den stängd (förseglad) tills klar för användning.
3. Öppna Spine, Laminektomi och råtta positionering (i 3D-ram)
- Placera djuret i en platt liggande horisontellt läge. Raka och rengör baksidan (thoraxregionen) av djuret.
- Identifiera det sista revbenet (trettonde i råtta) genom palpation (Figur 4). Detta gör att man kan uppskatta placeringen av XIII bröstkotan (ThXIII).
- Gör en 4 cm hudincision på mittlinjen, centrerad på ThXIII. Öppna snittet huden samt den underliggande bursa. Observera aponeurosis av ryggmusklerna samt tips av ryggrads ryggraden processer.
- Försiktigt lokalisera ryggraden processen för ThXIII palperas trettonde revbenen.
OBS: XIII ribban är ansluten till ThXIII och därför representerar en lätt locate anatomiska landmärke för identifiering av ThXIII. Detta steg möjliggör lokalisering av ThXII att ThIX spinalutskott samt L1 och L2 (första och andra ländkotorna). - Skär muskel aponeurosis och lossa musklerna på vardera sidan för att exponera spinous processer, lamellerna och facettleder från ThIX till L2. Exponera sido aspekterna av L1 och L2 genom att lossa muskler från de tvärgående processerna.
- Haka djurets framtänder på 3D-ram för att säkra positionen (Figur 5). Kläm L1 och L2 kotorna med modifierade pincett. Anslut de modifierade pincett till 3D-ram för att stabilisera djuret.
- Dra försiktigt caudally tången håller ländryggen för att dra hela ryggraden och att höja bröstkorgen från bänken.
OBS: Med det beskrivna arrangemanget djuret ska kunna andas. Vidare, trots respiratoriska rörelser av bröstkorgen, ryggraden och spinalsladden bör också förbli orörlig. - Ta bort ryggkotornas processer som från ThIX till ThXII. Försiktigt in sämre bladet benet saxen under vänster lamina av ThXII och stäng sedan benet saxen för att klippa lamina (Figur 6).
- Upprepa samma manöver för rätt lamina och successivt ta bort den bakre bågen. Upprepa föregående steg för kotorna ThXI till ThIX i syfte att uppnå en fyra-nivå laminektomi. Demontera båda facettleder för varje kota.
OBS: Under hela förfarandet, rengöra operationsområdet från lokal blödning. För att använda tops och bevattning med ljummet saltlösning. Hemostas sker systematiskt inom några minuter.
4. CEU Probe Positionering
- Täck dura mater med ultraljud gel. Detta möjliggör effektiv överföring av ultraljudvågorna mellan sonden och ryggmärgen (fig 7).
- Stabilisera ultraljudssond witha klämma som senare kan anslutas till 3D-ram med en ledad arm. Positionera sonden manuellt. Se till att sonden är orienterad för att erhålla en sned longitudinell sagittal skiva. I en korrekt position, är ryggmärgen strikt horisontell på bilden och den centrala kanalen av ryggmärgen är synlig utmed hela segment av ryggmärgen.
OBS: Positionering bör vägledas av realtids B-mode bilden som visas på skärmen på ultraljud maskin. Brännvidden hos ultraljudssonden bör anpassas till den centrala kanalen av ryggmärgen. Vid denna tidpunkt är den bakre sidan av ryggmärgen åtkomlig som i slutändan kommer att möjliggöra positionering av provkroppen. - När optimal, låsa ledad arm för att stabilisera läget.
5. Framställning av kontrastmedel - mikrobubblor Beredning
- Använda innehållet i en kommersiell beredning satsen och anslut kolvstången genom att fästa det tightly i sprutan (medurs). Öppna överföringssystemet blister och ta bort locket från sprutspetsen. Öppna överföringssystemet locket och koppla sprutan till överföringssystemet (fäst ordentligt).
- Ta bort skyddsskivan från injektionsflaskan. Skjut flaskan i den genomskinliga muffen på
- systemet och tryck på överförings ordentligt för att låsa flaskan på plats.
- Töm innehållet i sprutan i injektionsflaskan genom att trycka på kolvstången. Skaka kraftigt i 20 sekunder för att blanda allt innehåll i injektionsflaskan för att erhålla en vit mjölkaktig homogen vätska.
- Vänd systemet och försiktigt dra tillbaka kontrastmedlet i sprutan. Skruva loss sprutan från överföringssystemet. Efter beredning (enligt anvisningarna), 1 ml av den resulterande dispersionen innehåller 8 pl svavelhexafluorid i mikrobubblorna. Dra upp suspensionen av mikrobubblor i en 100 ml spruta. Sätt 100 ml sprutan i den elektriska pumpen. Stäng locket.
- Börja konstant omrörning av återinrättade mikrobubblor. Erhölls konstant omröring genom långsam rotation av sprutan, som bibehåller mikrobubbelsuspension. Koppla pumpen till den jugulara katetern genom den flexibla slangen. Ställ in ultraljudsmaskinen till "Övertonsläge".
OBS: De sistnämnda motsvarar det läge i vilket mikrobubblorna kan specifikt detekteras och visualiseras. Detta läge har ett lågt mekaniskt index, som inte förstör mikrobubblorna i motsats till B-läget. - Rensa katetern genom infusion av ett första dosen (400 ^ il) av kontrastmedlet. Under denna första infusionen, kontrollera att mikrobubblorna inte visas på ultraljudsskärmen. Detta bekräftar att hela kretsen (från sprutan till råttans blodet) är intakt och öppet.
- Ställ in ultraljudsmaskinen till "B-mode" för att visualisera ryggmärgen parenkymet och förstörelsen av de få mikrobubblor kvar i blodet. Den höga frekvensen av "B-läge" tranSmits hög energi till mikrobubblorna, som gör det möjligt för dem att bryta.
- Låt djuret låg stilla i ungefär 30 minuter. Denna period möjliggör stabilisering av de hemodynamiska parametrarna.
6. Bedömning av SCBF i Intakt ryggmärgs
- Ställ in ultraljudsmaskinen till "Övertonsläge". Börja samtidigt (1) infusion av kontrastmedel (400 | il) och (2) kronometern.
OBS: Under infusionen bör koncentrationen av mikrobubblor i blodet ökar, vilket möjliggör kontrast föreställa av ryggmärgen (figur 8). Eftersom mikrobubblorna snabbt förstörs, startar blodkoncentrationen av mikrobubblor minskar när injektionen är avslutad, som alstrar en progressiv minskning i kontrastvisualisering av ryggmärgen. - Efter 1 minut, välj (tryck) "Clip Store" på ultraljud maskin. Detta kommer att göra det möjligt att spara 1 min raw ultraljudsuppgifter och avbildnings videoinspelning (som tidigare visas på ultraljudsskärmen).
- Ställ in ultraljudsmaskinen till "B-läge". Detta kommer att undanröja de återstående mikrobubblor.
7. Experimentell SCI
- Använda mikromanipulator ansluten till 3D-ram, placera tyngden-släpp impac enheten så att spetsen på provkroppen kommer i kontakt med dura mater (på ryggmärgen mittlinje), vid korsningen mellan THX och ThXI (figur 9) .
OBS: Denna nivå bör motsvara mitten av segmentet av ryggmärgen som observerades med ultraljudsanordningen. Anfallaren och kropp kroppen är 8 mm i diameter. Spetsen av provkroppen, som kommer att generera den skada, är 3 mm i diameter. - Placera anfallaren av impac anordningen vid en 10 cm hög ställning. Framkalla den experimentella SCI genom att släppa anfallaren av Impac enheten. Anfallaren faller och släpper the kroppen, skadade ryggmärgen. Den skräddarsydda impac ger en effekt som motsvarar en 10 g vikt släpps från en höjd av 10 cm.
8. Bedömning av SCBF 5 min efter SCI
- Upprepa steg som beskrivs i avsnitt 6 (Bedömning av SCBF). Mikrobubblorna kommer inte att kunna passera genom den skadade mikrovaskulaturen och skadan epicentrum förblir mörk (Figur 10).
9. djuroffer
- Euthanize djuret med intraperitoneal letal injektion av pentobarbital (100 mg).
10. Kvantifiering av SCBF från offline analys
- Starta ultra Utöka programvara som används för kvantifiering (på ultraljud maskin). Välj "File" och välj sedan tidigare sparade rådata och öppna tillhörande filer. Aktivera "kvantifiering mode" genom att trycka på (välja) den "Chi Q" -knappen. Select "Set ROI" (knapp) och välj den cirkulära formen.
- Välj "Rita ROI" (knapp) och rita sju angränsande cirkulära områden av intresse (ROI) på ryggmärgen (Figur 11). Öppna menyn "Montering" och välj funktionen "Curve värde". Observera mjukvaran visar flera kurvor, var och en motsvarar förändringarna i mikrobubblorna koncentration inuti en ROI.
OBS: Varje kurva har en "perfusion-deperfusion" profil. Den första fasen av kurvan är platt och motsvarar perioden före ankomsten av mikrobubblor. I den andra fasen, ökar koncentrationen av mikrobubblor snabbt som ett resultat av infusionen. I den tredje fasen, som börjar när infusionen är klar, koncentrationen av mikrobubblor minskar progressivt när de disintegratse i blodet. - Placera den första vertikala linjen i början av den andra fasen av cUrve och välj "SET". Detta informerar programmet var man ska börja analys.
- Placera den andra vertikala linjen vid slutet av inspelningen och återigen välja "OK". Detta informerar programmet var att stoppa analys.
- Titta på menyn "CV" och registrera värdet "AUC", vilket motsvarar "området under kurvan" analyseras. Detta värde är proportionellt mot SCBF inuti motsvarande ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med det protokoll som beskrivits ovan är det möjligt att kartlägga SCBF längs en längsgående ryggmärgen sagittala segmentet.
I den intakta ryggmärgen, det verkar vara SCBF oegentligheter inom parenkymet (Figur 12). Detta kan förklaras av den variabla fördelningen av radiculo-medullära artärer (RMA) från ett djur till ett annat. RMA avser segment artärer som når den främre spinalartären (ASA) och därför ger blodtillförsel till ryggmärgen parenkymet. Däremot radicular artärerna motsvarar segmentell artärer, som inte uppnår den ASA och därför inte tillhandahåller ryggmärgsblodtillförsel. Därför, i ryggmärgs segment där RMA anastomos med ASA, det finns mer blodflöde (såsom visas i våra resultat).
Efter SCI, visar realtids CEU imaging en brist i omlopp på skade epicentrum. Epicentrum förblir mörk (inget kontrastmedel signal),eftersom det inte finns någon aktiv blodflöde. En mer detaljerad analys av blodflödet med hjälp av flera ROI visar tre unika blodflödes områden. Först, vid nivån för epicentrum, är blodflödet lägst med en genomsnittlig minskning på cirka -90%. För det andra, i de områden som gränsar till epicentrum (både rostralt och caudal), SCBF också minskat avsevärt (från -50% till -80%). För det tredje, i de mest avlägsna områdena motsvarar intakt vävnad, är SCBF bevaras. Det andra området motsvarar "ischemisk Penumbra zon", som bör vara föremål för potentiella nervskyddande behandlingar. Att kunna enkelt visualisera och kvantifiera SCBF förändringar efter SCI är användbar för att bedöma effektiviteten av terapier som syftar till att minska vävnadsischemi, och understryker därför vikten av denna teknik (Figur 13).
Figur 2. Schematisk bild av satsen för mikrobubblor beredning och Vueject ° pump som används för mikrobubblor infusion. Överföringssystemet möjliggör leverans av mikrobubblor och saltlösning mellan flaskan och sprutan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. jugular kateter. Katetern ska införas i halsvenen, sköt sedan mot hjärtat och slutligen fäst med en knut. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Metod för korrekt identifiering av de vertebrala nivåer. I råtta, är det sista revbenet fäst den trettonde ryggkotan. Det senare kan palperas genom huden som en milstolpe för den sista bröstkotan, den trettonde. Muskler är fristående på ömse sidor om spinous processer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Stabilisering av djuret i 3D-ramen. (1) De framtänder är hooked på ramen medan de första och andra ländkotorna (L1 och L2) kläms med skräddarsydda pincett. (2) Den ländryggen är något åtdragen som stabiliserar djuret och höjer bröstkorgen från bänken, vilket möjliggör fria andningsrörelser utan ryggrad rörelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Tekniska detaljer om laminektomi. Först den tunna blad av skräddarsydda ben cutter passerade under lamina utan att skada ryggmärgen. Då benet saxen är stängd, vilken cUTS och tar bort en del av det tunna skiktet. Proceduren upprepas på båda sidor och från ThXII till TxIX i syfte att uppnå en fyra-nivå laminektomi. Slutligen, facettleder är också bort. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Placering av ultraljudssonden och impaktion anordningen. Sonden är parallell till ryggmärgen och något snedställda (20-30 °), så att vikten-släpp Kroppen kan placeras mot den bakre sidan av dura. Ryggmärgen ska synas med den centrala kanalen närvarande i hela mellansegmentet på ultraljud "B-läge". Klicka här för att seen större version av denna figur.
Figur 8. Kontrast avbildning av den intakta ryggmärgen. De successiva figurer i kontrastläge (orange färgade bilder) visar hur kontrastmedel (mikrobubblor) visas successivt efter infusionen, vilket ökar kontrasten i ryggmärgen. Bolusinfusion varar ca 10 sekunder och data kontrast registrerades under 1 minut. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Förändringar i B-läget följande experimentella SCI. En hyperechoic lesion visas inuti parenkymet, som motsvarar den ursprungliga parenkymala h emorrhage efter SCI. Histologi (H & E-färgning): blödning Resultaten från massiva traumatiska avbrott i små blodkärl som leder till blod extravasering i parenkymet (gul skala bar = 2,000 um). Den impac enheten visas på höger sida. Anfallaren frigörs från en 10 cm höjd och kolliderar med kroppen som sedan genererar ryggmärgsskada. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10. Kontrast avbildning 15 min efter SCI. I likhet med fig 8, mikrobubblorna är synliga när de passerar genom ryggmärgen mikrovaskulaturen. Vid epicentrum (asterisk), är blodflödet hindras av mikrovaskulär störning.10large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11. Protokoll för SCBF kvantifiering. Med Ultra-Förläng programvara, är sju runda och angränsande regioner av intresse (ROI) dras på längd ryggmärgen bilden. Den första ROI placeras på skade epicentrum. I varje ROI, genererar programmet en perfusion-deperfusion kurvan och beräknar arean under denna kurva. Detta värde korrelerar med blodflödet i detta område. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12. Heterogena blodflödet längsryggmärgen. Dessa grafer visar heterogenitet ryggmärgen blodflödet samt variationen mellan djur. Detta kan till stor del förklaras av den vaskulära anatomin i ryggmärgen. Men på grund av den heterogenitet och rörlig vaskulär anatomi, måste man använda de blodflödesmätningar (från varje ROI) före skadan som baslinje. De mätningar som gjorts vid följande tidpunkter (efter SCI) uttrycks som procenttal ändring av baslinjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 13. Förändringar i ryggmärg blodflöde (SCBF) inducerad av den experimentella ryggmärgsskada (SCI). 15 min efter SCI finns kritisk ischemi i nivå med epicentrum medan SCBF förblev preserveras i de mer avlägsna intakta områden. I de regioner som gränsar till epicentrum (både rostralt och caudal) är SCBF minskas betydligt. Detta motsvarar den tidigare beskrivna "ischemisk Penumbra zon". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om vi har beskrivit hur man använder CEU i en råtta SCI kontusion modell, kan detta protokoll ändras för att passa andra experimentella mål eller SCI modeller. Vi har valt att mäta SCBF endast två tidpunkter (före skadan och 15 minuter efter SCI), men antalet tidpunkter och fördröjningen mellan SCBF mätningar kan anpassas för att uppfylla behoven hos andra studier. Till exempel, i vårt tidigare arbete 17 har vi mätt SCBF vid fem på varandra följande tidpunkter under hela den första timmen efter SCI. Det är viktigt att notera att i skengruppen (ingen SCI), blev vi förvånade över att observera en successiv minskning av SCBF. Samtidigt som vi ursprungligen befarade att upprepade mikrobubblor infusion kan skada ryggmärgen kärl ytterligare experiment (opublicerade data) bekräftade att dessa förändringar orsakades av progressiva förändringar i lokal vävnads fysiologiska förhållanden (temperatur, fukt) inducerade av laminektomi, liksom den långvariga utläggning av than dura och omgivande vävnad till den omgivande luften och ultraljudsgel. Dessa problem är vanliga i alla experiment som behandlar mikro, som cirkulationen är extremt känslig för många parametrar och därför benägna att vascoconstriction eller vasodilatation. Därför rekommenderar vi att den period under vilken operationssåret är öppen är så kort som möjligt. Om flera mätningar SCBF behövs under en längre period, skulle det vara bättre att stänga djur snitt mellan förvärv för att återställa fysiologiska förhållanden runt och inne i ryggmärgen.
Det är också möjligt att ändra form, storlek, läge och antalet ROI för SCBF analys. En av de stora fördelarna med CEU är att mätningarna kan göras när som helst efter experimentell slutförande genom att bearbeta det inspelade data offline. Det är också möjligt att upprepa mätningarna eller ändra inställningarna mätning / normer vid behov.
Rumslig upplösning av ultraljudavbildning är proportionell mot frekvensen för ultraljudvågorna. Ju högre ultraljudsfrekvens, desto bättre rumslig upplösning. Vi har använt en hög-Frekvensomriktare utan integrerat sinus (12-14 MHz) sond, som ger en bild med en upplösning av ca 100 ^ m. Med mycket-högupplösta system, ökar frekvensen upp till 55 MHz och varje bildelement är cirka 20 | im 20. Sådana anordningar kan också användas för CEU, som skildrar mycket mer exakt fördelningen av SCBF i parenkymet. Emellertid den mycket-högupplösta system är mycket dyrare.
Flera andra tekniker har föreslagits för att mäta SCBF i SCI, men de har alla unika begränsningar. Vissa, såsom radioaktiva mikrosfärer 7,8 eller C14-jod-antipyrin autoradiografi 9, kräver djuroffer. I dessa fall måste ryggmärgen skördas för analys. Å andra sidan, det fria väteteknik 10, kräver intraspinal elektrodinför som faktiskt kan ändra SCBF. Vidare kan endast göras mätningen i en mycket begränsad region av ryggmärgen parenkymet. Ijusmikroskopigenom ett ryggrads fönster ger också ett sätt att bedöma mikrocirkulationen, men detta tillvägagångssätt har ett mycket begränsat djup av observation. Det gör bara att observera omsättning i den ytliga pia frågan och inte inom parenkymet 16.
I litteraturen är realtid in vivo bedömningar av SCBF vanligtvis med laser Doppler imaging 11-13. Emellertid har även denna teknik ett flertal begränsningar. För det första, eftersom lasern är mindre än 1 mm i diameter, SCBF kan endast bedömas i ett mycket begränsat område som motsvarar en halvsfär av ca 1 mm i diameter. Sedan råttans ryggmärg är cirka 3 mm i diameter, är den begränsade analysområde ett stort hinder. Dessutom, som vi har visat att SCBF i den intakta ryggmärgen är inte homogen, är det viktigt att mäta SCBF i ett större område för en riktig representation av vävnadsmikrocirkulation. För det andra har lasern en begränsad inträngningsdjup och därför deteCTs ytlig SCBF. Som ett resultat, är det inte bara mäter parenkymal SCBF utan även den för pia mäter (som omger parenkymet). Eftersom pia mater har en unik kärlsystemet och inte utsätts för samma auto reglerande mekanismer som parenkyma fartyg, kan denna information vara vilseledande. Slutligen, anser laser-Doppler inte ge någon morfologisk information. CEU vinner sådana begränsningar genom att visa morfologiska bilder av sladden (B-läge), medan unikt presentera kontrastmedel som tydligt kan identifieras inom parenkymet.
Trots sina många fördelar med att andra metoder, har CEU också några tydliga begränsningar. Eftersom mätningar görs på en tvådimensionell sagittal skiva (vanligtvis parallellt med den centrala kanalen), SCBF från andra delar av parenkymet är otillgängliga. Vidare kan den information som genereras av en enda tvådimensionell sagittal ryggmärgen segmentet inte vara representativa för hela sladden. Nevertheless, kan detta kontrolleras genom flera försiktighetsåtgärder. Först genom att upprepa mätningar på samma plats, gjorde den första mätningen (intakt ryggmärg) kan användas som ett utgångsvärde. För det andra, genom att skada på ryggmärgen mittlinje (bilateral skada) bör SCBF förändringar vara symmetriska mellan vänster och höger (opublicerade data). Dessa försiktighetsåtgärder bidra till att analysen av en enda sagittal skiva är tillräckligt för att återspegla den globala längd fördelningen av SCBF.
De höga kostnaderna för ultraljud maskiner är en annan begränsning. Det finns emellertid flera lösningar för att rikta detta problem. För det första kan vissa laboratorier förhandla fram ett tillfälligt lån av tillverkaren för sina experiment. Eftersom ultraljud maskiner är transportabla, tillfälliga lån är möjligt. Detta har varit den metod som används av vårt laboratorium. Alternativt kan en grupp laboratorier samla resurser för att köpa maskinen och dela kostnaderna. Annars många universitetsinstitutioner har imaging faciliteter och ultraljud maskins kan rekommenderas som viktiga verktyg. Således kan djuren transporteras bild anläggning för CEU bedömning och sedan kom tillbaka för andra experiment.
För att bedöma kärlförändringar, kontrastmedels (mikrobubblor) måste injiceras intravenöst. Även kateterisering av hals eller lårbensvenen är invasiv och riskabelt, venerna är lättillgängliga och tydligt identifierbara. Däremot är injektion i svansvenen mycket mindre invasiva, men kärlet är dåligt stående / synligt för korrekt kateterisering. Därför finns det en risk att nålspetsen inte blir korrekt placerad inuti venen eller att det kan röra sig under injektion, kompromissa hela experimentet. För en sådan anledning, föredrar vi att använda halsvenen och införa en kateter för konsekvent mikrobubblor infusion.
Kota ben omger ryggmärgen. Som ultraljudsvågor reflekteras av ben och kan inte passera genom ryggmärgs lamellerna kräver avbildningbenborttagning (laminektomi) för att öppna en akustisk fönster. Det enklaste sättet att öppna ryggradskanalen är att ta bort den bakre bågen av kotan genom en laminektomi. I detta protokoll, kräver vi en fyra-nivå laminektomi att visualisera en lång segment av ryggmärgen, inklusive epicentrum, halvskuggan zonen och avlägsna delar av intakta ryggmärgen. Även om en majoritet av experimentella SCI modeller kräver en laminektomi (för klipp ansökan eller kroppen kontusion), dessa består vanligen av att ta bort 1-2 lamina. Den omfattande 4-nivå laminektomi är en annan begränsning av vår studie. Men om man behöver bara studera epicentrum och Penumbra zon, en mindre omfattande laminektomi kan göras och rekommenderas.
Sammanfattningsvis, trots de många begränsningar som beskrivs ovan, är CEU ett användbart verktyg för att bedöma SCBF förändringar och effekten av olika behandlingar (forskningsändamål). Denna tillförlitliga, i realtid, tillvägagångssätt är idealisk in vivo för att titta på behandlingar för att minskaischemi och efterföljande vävnadsnekros efter SCI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- MacDonald, J. W., Sadowsky, C.
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Martirosyan, N. L., et al. Blood supply and vascular reactivity of the spinal cord under normal and pathological conditions. J Neurosurg Spine. 15 (3), 238-251 (2011).
- Blight, A. R. Cellular morphology of chronic spinal cord injury in the cat: analysis of myelinated axons by line-sampling. Neuroscience. 10 (2), 521-543 (1983).
- Bassingthwaighte, J. B., et al. Validity of microsphere depositions for regional myocardial flows. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H184-H193 (1987).
- Drescher, W. R., Weigert, K. P., Bunger, M. H., Hansen, E. S., Bunger, C. E. Spinal blood flow in 24-hour megadose glucocorticoid treatment in awake pigs. J Neurosurg. 99 (3 Suppl), 286-290 (2003).
- Golanov, E. V., Reis, D. J. Contribution of oxygen-sensitive neurons of the rostral ventrolateral medulla to hypoxic cerebral vasodilatation in the rat. J Physiol. 495 (Pt 1), 201-216 (1996).
- Ueda, Y., et al. Influence on spinal cord blood flow and function by interruption of bilateral segmental arteries at up to three levels: experimental study in dogs). Spine (Phila Pa 1976). 30 (20), 2239-2243 (2005).
- Carlson, G. D., et al. Sustained spinal cord compression: part II: effect of methylprednisolone on regional blood flow and recovery of somatosensory evoked potentials). J Bone Joint Surg Am. 85-A (1), 95-101 (2003).
- Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 32 (18), 1955-1962 (2007).
- Horn, E. M., et al. The effects of intrathecal hypotension on tissue perfusion and pathophysiological outcome after acute spinal cord injury). Neurosurg Focus. 25 (5), E12 (2008).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Ishikawa, M., et al. Platelet adhesion and arteriolar dilation in the photothrombosis: observation with the rat closed cranial and spinal windows. J Neurol Sci. 194 (1), 59-69 (2002).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (1976).
- Huang, L., et al. Quantitative assessment of spinal cord perfusion by using contrast-enhanced ultrasound in a porcine model with acute spinal cord contusion). Spinal Cord. 51 (3), 196-201 (2012).
- Postema, M., Gilja, O. H.
- Soubeyrand, M., Badner, A., Vawda, R., Chung, Y. S., Fehlings, M. Very High Resolution Ultrasound Imaging for Real-Time Quantitative Visualisation of Vascular Disruption After Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. , (2014).
- Akhtar, A. Z., Pippin, J. J., Sandusky, C. B. Animal models in spinal cord injury: a review. Rev Neurosci. 19 (1), 47-60 (2008).
