Rechtop Imaging van<em> Drosophila</em> Egg Chambers

Summary

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Abstract

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Introduction

Studie van Drosophila melanogaster heeft grote inzichten in de genetische regulatie van diverse verschijnselen. Met name is er uitgebreid onderzoek ei ontwikkeling, omdat oögenese biedt handelbaar manier om veel verschillende ontwikkelingsprocessen, waaronder weefsel patronen, cel polariteit, celcyclus schakelen en translationele regulering ^1,2,3,4 onderzoeken. Een belangrijke morfogene gebeurtenis tijdens oögenese is de specificatie verwerving van motiliteit en migratie van een set cellen genaamd grens cellen (beoordeeld in ^5). Aangezien celmigratie is een belangrijk kenmerk van dierlijke morfogenese en omdat de genetische regulatie van dit proces is goed geconserveerd mechanismen vastgesteld vliegen waarschijnlijk belangrijk in andere contexten zijn. Zo onderzoeken we de moleculaire controle van de grens cel migratie. Voor onze studies hebben we een nieuwe methode om de voorste polen ontwikkelen eieren observeren ontwikkeldwaar de grens cellen ontstaan, te onderzoeken hoe ze zich ontwikkelen in detail.

In de eierstok, ei kamers in verschillende ontwikkelingsstadia bestaan ​​langs ketens genaamd ovarioles, die zijn ingekapseld in een dunne omhulling (Figuur 1A). Elk ei kamer zal gaan om een ​​ei te vormen. Tijdens oögenese, moet een aantal verschillende celtypen te ontwikkelen op een gecoördineerde manier. De D. melanogaster ei kamer bestaat uit 16 kiembaan cellen, waaronder één eicel, omgeven door een single-layer folliculair epitheel ^6. Een klein aantal gespecialiseerde cellen, genaamd poolcellen, ontstaat op de voorste en achterste polen van het epitheel. De 6-8 grens cellen ontstaan ​​in de voorste epitheel van het ei kamer, veroorzaakt door de polaire cellen ^5,7. Medio oögenese (fase 9), de grens cellen los te maken van hun buren en migreren tussen de verpleegkundige cellen om de eicel te bereiken op de achterkant van het ei kamer ^5,7. Deze beweging moet worden bereiktterwijl de grens cellen blijven in een cluster rond twee niet-polaire beweeglijke cellen, waardoor dit een soort collectieve celmigratie. Succesvolle migratie van de grens celcluster zorgt voor een goede ontwikkeling van de micropyle van de eierschaal, die nodig is voor bevruchting.

De voorste polaire cellen instrueren grens lot van de cel door het activeren van een signaaltransductie cascade. Polar cellen scheiden een cytokine, Unpaired (UPD), dat bindt aan een transmembraan receptor, Domeless (DOME), op aangrenzende follikel cellen tijdens fase 8 van eicelontwikkeling ^8,9. De binding van UPD veroorzaakt Janus tyrosine kinase (JAK) tot fosforylering het Signal Transducer en Activator van de transcriptie (STAT) ^8,10,11. STAT dan naar de kern om transcriptie te activeren. Langzaam Border Cells (SLBO) is een transcriptiefactor die een directe transcriptionele doel van STAT en is ook vereist voor grens celmigratie ^12. Zijdelings uitzicht ei kamers geven thoed STAT activiteit wordt geregeld in een gradiënt over de voorste epitheel ^8,11,13. Follikelcellen dichtst bij de polaire cellen de hoogste niveaus van geactiveerde STAT aldus worden zij rand cellen en binnenvallen aangrenzende kiemlijn weefsel.

Om te begrijpen hoe de grens cellen worden gespecificeerd binnen en losmaken van het epitheel, moeten we om te zien hoe het weefsel wordt georganiseerd. Als we ei kamers bekijken vanuit een anterieure-on perspectief, zouden we radiale symmetrie van STAT activiteit verwachten in de follikel cellen rondom de polaire cellen. Een eindaanzicht ook beter verschillen van membraaneiwitten en cel-cel-interfaces tonen vóór en tijdens losmaken dan vergeleken cellen in verschillende beeldvlakken. Omdat ei kamers zijn langwerpig en aan elkaar steel cellen, zij regelen op objectglaasjes lateraal, waardoor het moeilijk om de voorste architectuur observeren. Zo veel informatie over de cellen bij de polen van de ei kamer heeftis afgeleid uit een zijdelings uitzicht. Hoewel sommige informatie kan worden verkregen via algoritmische 3-D reconstructies van optische secties, lichtverstrooiing, fotobleken, en de armere grenzen van de resolutie in de Z-as te maken van deze informatie minder gedetailleerd en betrouwbaar in de afwezigheid van dure technieken als super-resolutie microscopie ¹⁴ . Andere soorten doorsnede Beeldvormende (bijvoorbeeld elektronenmicroscopie of microtoom snijden) dat uitgebreide manipulatie van weefsels, zoals uitdroging, waardoor de kans op artefacten. Zo, een nieuwe methode om de afbeelding D. ontwikkelden we melanogaster ei kamers terwijl rechtop. Deze methode heeft zijn nut al bewezen in het ophelderen hoe beweeglijke cellen zijn gedoemd (zie Representatieve resultaten en Manning et al, onder review), en zal waarschijnlijk meer in het algemeen waardevol in studies van andere aspecten van oögenese zijn.

Protocol

1. Dissectie van Ovarioles Breng ongeveer vijftien 2-4 dagen oude vrouwtjes en een paar mannetjes om een ​​frisse vlieg voedsel flacon met toegevoegde actieve droge gist. Gebruik katoen als een plug voor de flesjes, en voeg een paar druppels water aan de katoen om de luchtvochtigheid hoog te houden. Plaats flacon in een 25 ° C incubator gedurende 14-16 uur bij podiummonitoren 8-10 ei kamers maximaliseren. OPMERKING: Incubatie varieert afhankelijk van de temperatuur en de gewenste fase. <…

Representative Results

De opstaande beeldvormingswerkwijze konden we direct de organisatie van cellen in de voorste folliculaire epithelium zien in stap 8. een algemene merker voor follikel lot van de cel, de ogen Afwezig (EYA) proteïne, alsmede de nucleaire DNA merker DAPI vertoonde zelfs expressie in dit gebied van cellen, en dat voor alle cellen konden worden waargenomen met gelijke kleuring intensiteit (Figuur 2B "). Eiwitten geregeld in reactie op de cytokine UPD toonde echter variabele patronen en expressieniveaus…

Discussion

Hier wordt een methode beschrijven we te monteren en het imago kleine, ontwikkelen ei kamers van een end-on perspectief. Gemeenschappelijke technieken voor beeldvorming ei kamers zijn geoptimaliseerd voor een zijdelings uitzicht en in de eerste plaats maken een nauwkeurige visualisatie van medio-laterale follikel cellen na kleuring met fluorescerende antilichamen. Het gebruik van Z-stacks of 3-D reconstructies helpt bij het ​​bekijken van meerdere focale vlakken, maar is nog steeds onvoldoende voor subcellulaire res…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer)			Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C.
16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	15710	methanol-free to preserve GFP fluorescence
30G x 1/2 inch needle	VWR	BD305106	Regular bevel
Active Dry Yeast	Genesee Scientific	62-103	To fatten female flies
Bovine Serum Albumin	PAA-cell culture company	A15-701	Used in NP40 Wash Buffer
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10	Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich	D9542	5mg/ml stock solution
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16140-071	Added to supplement dissection medium (10%)
Glass culture tube	VWR	47729-576	14mL
Glass Depression Slides	VWR	470019-020	1.2 mm Thick, Double Cavity
Glycerin Jelly	Electron Microsocpy Sciences	17998-10	Mounting media
Glycerol	IBI Scientific	IB15760	70% in PBS
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I3021-500ML	(interchangable for Nonidet P-40)  Used in NP40 Wash Buffer
Leica Fluorescent Stereoscope	Leica Microsystems
Leica SP5 Confocal Microscope	Leica Microsystems		40x/0.55NA dry objective
Micro spatula	VWR	82027-518	Stainless steel
Microknife	Roboz Surgical Instrument Company	37-7546	45ᵒ angle
Microscope Slide	VWR	16004-368	75x25x1 mm
NP40 Wash Buffer			50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Life Technologies	10378-016	Added to supplement dissection medium (0.6X)
Petridish- Polysterine, sterile	VWR	82050-548	60Wx15H mm
Phosphate Buffer Saline	Sigma Aldrich	P3813-10PAK	10 packs of Powder
Potassium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	P3786-500G	Used in 0.1M KPO4 Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P9791-500G	Used in 0.1M KPO4 Buffer
Schneider’s Insect Medium	Life Technologies	11720018	With L-glutamine and sodium bicarbonate
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-25G	Used in fluorescent antibody staining
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014-500G	Used in NP40 Wash Buffer
TRIS-HCL	IBI Scientific	IB70144	1M TRIS-HCL, pH 7.4
Volocity 3D Image Analysis Software	PerkinElmer		For processing confocal Z-stacks