Imagem Vertical de<em> Drosophila</em> Câmaras de ovo
Summary
The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.
Abstract
Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.
Introduction
Estudo da Drosophila melanogaster tem proporcionado grandes insights sobre a regulação genética de uma ampla gama de fenômenos. Em particular, tem havido uma extensa pesquisa sobre o desenvolvimento do ovo, porque oogenesis fornece uma maneira dócil para investigar vários processos de desenvolvimento diferentes, incluindo padrões de tecidos, alterações de polaridade celular, comutação do ciclo celular, e regulação de translação 1,2,3,4. Um evento morphogenic importante durante oogenesis é a especificação, aquisição de motilidade, e migração de um conjunto de células, chamadas de células de fronteira (revisto em 5). Uma vez que a migração celular é uma característica fundamental da morfogénese dos animais, e porque a regulação genética do presente processo é bem conservada, determinados mecanismos de moscas são susceptíveis de ser importante em outros contextos. Assim, estamos investigando o controle molecular da migração celular fronteira. Para os nossos estudos, desenvolvemos um novo método para observar os pólos anterior de desenvolvimento de ovos,onde surgem as células de fronteira, para examinar como elas se desenvolvem em detalhe.
Dentro do ovário, câmaras de ovo em várias fases de desenvolvimento existir ao longo das cadeias chamadas ovarioles, que são envolvidas por uma bainha fina (Figura 1A). Cada câmara ovo vai continuar a formar um ovo. Durante oogenesis, vários tipos de células diferentes deve desenvolver-se de forma coordenada. O D. câmara melanogaster ovo é composto por 16 células germinativas, incluindo um oócito, cercado por uma única camada de epitélio folicular 6. Um pequeno número de células especializadas, chamadas células polares, surgem as anteriores e posteriores pólos do epitélio. As células de fronteira 6-8 originam no epitélio anterior da câmara de ovo, induzida pelas células polares 5,7. Em meados de oogénese (etapa 9), as células de fronteira desanexar das suas vizinhas e migram entre as células de enfermagem para atingir o oócito na parte posterior da câmara do ovo 5,7. Este movimento deve ser realizadoenquanto que as células permanecem na fronteira um cluster circundante duas células polares não-móveis, tornando este um tipo de migração celular colectiva. Migração bem-sucedida do grupo de células de fronteira garante o bom desenvolvimento da micrópila da casca do ovo, que é necessário para a fertilização.
As células polares anteriores instruir destino celular fronteira ativando uma cascata de transdução de sinal. Células polares secretar uma citocina, Unpaired (UPD), que se liga a um receptor de membrana, Domeless (DOME), na vizinha células foliculares durante a fase de desenvolvimento do oócito 8 8,9. A ligação da UPD provoca Janus tirosina quinase (JAK) para fosforilar o transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) 8,10,11. STAT, em seguida, move-se para o núcleo para activar a transcrição. Células de Fronteira lenta (SLBO) é um fator de transcrição que é um alvo direto da transcrição do STAT e também é necessário para a migração celular fronteira 12. Vistas laterais de câmaras de ovos indicam tatividade STAT chapéu é regulada em um gradiente através do epitélio anterior 8,11,13. Células do folículo mais próximos às células polares têm os mais altos níveis de STAT ativado, assim, tornam-se células de fronteira e invadir o tecido germinal adjacente.
Para entender como as células de fronteira são especificados dentro e destacar do epitélio, precisamos observar como o tecido é organizado. Se virmos câmaras de ovos de uma perspectiva anterior-on, esperaríamos simetria radial da atividade STAT nas células foliculares que cercam as células polares. Um fim-em vista também mostram mais precisamente as diferenças de proteínas de membrana e interfaces célula-célula antes e durante o descolamento do que comparando células em diferentes planos focais. Porque câmaras de ovo são oblongas e ligados uns aos outros por células pedunculares, estabelecem-se em lâminas lateralmente, tornando-o difícil de observar a arquitectura anterior. Assim, muita informação sobre as células nos pólos da câmara de ovo temsido inferida a partir de vistas laterais. Embora algumas informações podem ser obtidas através de algoritmos reconstruções 3-D de secções ópticas, espalhamento de luz, fotodegradativas e limites mais pobres da resolução no eixo Z tornar essa informação menos detalhada e confiável na ausência de técnicas caras, como microscopia de super-resolução 14 . Outros tipos de imagem baseado em seção (por exemplo, microscopia eletrônica ou microtome seccionamento) exigem extensa manipulação de tecidos, incluindo a desidratação, aumentando a probabilidade de artefatos. Assim, foi desenvolvido um novo método para a imagem D. câmaras melanogaster ovos, enquanto na posição vertical. Este método já provou útil para elucidar como células móveis estão fadados (ver resultados representativos e Manning et al, em revisão), e é provável que seja mais amplamente útil em estudos de outros aspectos da oogenesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós descrevemos um método para montar e pequena imagem, o desenvolvimento de câmaras de ovos de uma perspectiva end-on. Técnicas comuns para câmaras de ovos de imagem são otimizados para vistas laterais e permitir principalmente a visualização precisa das células do folículo medio-lateral quando coradas com anticorpos fluorescentes. O uso de Z-stacks ou 3-D reconstruções auxilia na visualização de vários planos focais, mas ainda é insuficiente para a resolução de sub-celular dos pólos de câmaras…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O’Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14mL |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microknife | Roboz Surgical Instrument Company | 37-7546 | 45ᵒ angle |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60Wx15H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCL | IBI Scientific | IB70144 | 1M TRIS-HCL, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
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