Вертикальный Визуализация Drosophila Яйцо палат

Summary

Метод вертикальной визуализации, описанный в этом протоколе, позволяет детально визуализировать полюса развивающегося яйца Drosophila melanogaster. Этот взгляд со стороны дает новый взгляд на расположение и морфологию нескольких типов клеток в фолликулярном эпителии.

Abstract

Оогенез Drosophila melanogaster обеспечивает идеальный контекст для изучения различных процессов развития, поскольку яичник относительно прост по архитектуре, хорошо охарактеризован и поддается генетическому анализу. Каждая яйцевая камера состоит из клеток зародышевой линии, окруженных одним эпителиальным слоем клеток соматического фолликула. Подмножества фолликулярных клеток подвергаются дифференцировке на определенных стадиях, превращаясь в несколько различных типов клеток. Стандартные методы в первую очередь позволяют получить боковой обзор яйцеклеток и, следовательно, ограниченный взгляд на организацию и идентичность фолликулярных клеток. Протокол вертикальной визуализации описывает технику монтажа, которая позволяет получить новый вертикальный вид яйцевых камер с помощью стандартного конфокального микроскопа. Образцы сначала монтируются между двумя слоями глицеринового желе в боковом (горизонтальном) положении на предметном стекле стеклянного микроскопа. Затем желе с оболочкой из яйцевых камер разрезают на блоки, перекладывают на покровную крышку и переворачивают, чтобы установить яйцевые камеры вертикально. Смонтированные яйцевые камеры могут быть визуализированы как в вертикальном, так и в перевернутом конфокальном микроскопе. Этот метод позволяет изучать спецификацию фолликулярных клеток, организацию, молекулярные маркеры и развитие яйцеклеток с новыми подробностями и с новой точки зрения.

Introduction

Исследование дрозофилы оказывает большое понимание генетического регулирования в широком диапазоне явлений. В частности, было обширное исследование развития яиц, потому что оогенез обеспечивает послушный путь, чтобы исследовать различные процессов развития, в том числе ткани рисунка, изменения клеточной полярности, переключение клеточного цикла и поступательного регулирования ^1,2,3,4. Одним из важных событий во морфогенетического оогенезе это спецификация, приобретение подвижности и миграции из набора клеток, называемых пограничные клетки (обзор в ^5). Поскольку миграции клеток является ключевым признаком животного морфогенеза, и из-за г....

Protocol

1. Вскрытие овариол

1. Перевести около пятнадцати 2-4-дневных женского мух и несколько мужчин к новому лету пищевой флакон с добавлением активных сухих дрожжей. Используйте хлопок в качестве плагина для флаконов и добавить несколько капель воды к хлопку, чтобы сохранить высокую влажность.
2. Место флакона в 25 ° C инкубаторе в течение 14-16 ч, чтобы максимизировать количество стадия 8-10 яиц камер.
   Примечание: Время инкубации варьируется в зависимости от температуры и желаемой стадии.
3. Подготовка рассечение СМИ, 0,1 М КПО ₄ и NP40 решения по мере необходимости в течение следующего дня (см Материалы).
4. Обезболить мух ....

Results

Метод прямой визуализации позволил нам увидеть непосредственно в организацию клеток в передней фолликулярного эпителия на стадии 8. общим маркером для судьбы фолликул клеток, об отсутствии Глаза (ЕЯ) белок, а также маркер ядерной ДНК DAPI, показали даже выражение по этой области клеток, и показали, что все клетки можно рассматривать с аналогичными интенсивности окрашивания (Фигура 2В "). Белки, регулируемые в ответ на цитокинов UPD, однако, показали переменных модели и уровни экспрессии. Полярные клетки.......

Discussion

Здесь мы опишем метод монтажа и изображение небольшой, развивающееся яйцо камеры с точки зрения конечного дальше. Общие методы для работы с изображениями яйца камер оптимизированы для боковым видом и, прежде всего, позволяют точно визуализировать Медио-боковая фолликулярных клеток при окраске флуоресцентными антителами. Использование Z-стеки или 3-D реконструкций средств при просмотре нескольких фокальных плоскостей, но по-прежнему недостаточно для субклеточном разрешением полюсов эллиптических яиц камер (рис 2D.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 М буфер фосфата калия (KPO4 Buffer)			Добавьте 3,1 г2PO4• H2O и 10,9 г Na2HPO4 (безводный) в дистиллированную H2O для получения объема 1 л. pH конечного раствора будет равен 7,4. Этот буфер может храниться до 1 месяца при температуре 4°C.
16% Параформальдегид водный раствор, класс EM	Электронная микроскопия Sciences	15710	без метанола для сохранения флуоресценции GFP
30G x 1/2 дюйма игла	VWR	BD305106	Регулярный скос
Активные сухие дрожжи	Genesee Scientific	62-103	Для откорма самок
Сыворотка крупного рогатого скота Альбумин	PAA-клеточная культура компании	A15-701	Используется в буфере для промывки NP40
Щипцы Dumont #5 Инструменты	для тонкой науки	11295-10	Сплав Dumostar, биологический наконечник; острые кончики необходимы для вскрытия
овариолаDAPI (4′,6-Diamidino-2-фенилиндола дигидрохлорид)	Sigma Aldrich	D9542	5 мг/мл стоковый раствор
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Life Technologies	16140-071	Добавлен в добавку диссекционной среды (10%)
Стеклянная пробирка для культивирования	VWR	47729-576	14 мл
Стеклянные депрессионные стекла	VWR	470019-020	толщиной 1,2 мм, двухполостное
глицериновое желе	Electron Microsocpy Sciences	17998-10	Монтажная среда
Глицерин	IBI Scientific	IB15760	70% в PBS
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I3021-500ML	(взаимозаменяемый для Nonidet P-40)  Используется в буфере для стирки NP40
Флуоресцентный стереоскоп Leica	Leica Microsystems
Leica SP5 Конфокальный микроскоп	Leica Microsystems		40x/0.55NA сухой объектив
Микрошпатель	VWR	82027-518
Предметное стекло для микроскопа	VWR	16004-368	75x25x1 мм
NP40 Буфер			50 мМ TRIS-HCl, 150 мМ NaCl, 0,5% ипегал, 1 мг/мл BSA и 0,02% азид натрия
Пенициллин-стрептомицин-глутамин	Life Technologies	10378-016	Добавлен в дополнение к среде для вскрытия (0,6X)
Петридиш-Полистерин, стерильный	VWR	82050-548	60 Вт x 15 Н мм
Фосфатный буфер физиологический раствор	Sigma Aldrich	P3813-10PAK	10 упаковок порошкового
фосфата калия двухосновного	Sigma Aldrich	P3786-500G	используется в 0,1 м KPO4 Buffer
Калийфосфат одноосновной	Sigma Aldrich	P9791-500G	используется в 0,1 м КПО<под>4 Буфер
[header]
Schneider' s Insect Medium	Life Technologies	11720018	с L-глутамином и бикарбонатом натрия
Азид	натрия Sigma Aldrich	S2002-25G	Используется при окрашивании флуоресцентными антителами
Хлорид натрия	Sigma Aldrich	S3014-500G	Используется в буфере для промывки NP40
TRIS-HCl	IBI Scientific	IB70144	1 м TRIS-HCl, pH 7,4
Volocity 3D изображение Аналитическое программное обеспечение	PerkinElmer		Для обработки конфокальных Z-стеков