Imaging Upright de<em> Drosophila</em> Cámaras de huevo
Summary
The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.
Abstract
Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.
Introduction
Estudio de Drosophila melanogaster ha proporcionado grandes conocimientos sobre la regulación genética de una amplia gama de fenómenos. En particular, ha habido una extensa investigación en el desarrollo de huevo, porque la ovogénesis proporciona una forma manejable para investigar muchos procesos de desarrollo diferentes, incluyendo patrones de tejido, los cambios de polaridad celular, la conmutación del ciclo celular, y la regulación de traducción 1,2,3,4. Un evento morfogénica importante durante la ovogénesis es la especificación, la adquisición de la motilidad, y la migración de un conjunto de células llamadas células de frontera (revisado en 5). Puesto que la migración celular es una característica clave de la morfogénesis animal, y porque la regulación genética de este proceso está bien conservada, mecanismos determinados en las moscas son propensos a ser importante en otros contextos. Por lo tanto, estamos investigando el control molecular de la migración celular frontera. Para nuestros estudios, hemos desarrollado un nuevo método para observar los polos anteriores de desarrollo de los huevos,donde surgen las células de frontera, para examinar cómo se desarrollan en detalle.
Dentro del ovario, existen cámaras de huevos en las distintas etapas de desarrollo a lo largo de las cadenas de llamadas ovarioles, que están provistas de un revestimiento delgado (Figura 1). Cada cámara de huevos pasará a formar un huevo. Durante la ovogénesis, varios tipos diferentes de células deben desarrollar de manera coordinada. El D. cámara de huevos melanogaster consta de 16 células de la línea germinal, entre ellos uno de los ovocitos, rodeado de una sola capa de epitelio folicular 6. Un pequeño número de células especializadas, llamadas células polares, surgen en los anteriores y posteriores polos del epitelio. Las células del borde 6-8 se originan en el epitelio anterior de la cámara de huevos, inducida por las células polares 5,7. A mediados de la ovogénesis (etapa 9), las células se desprenden de la frontera de sus vecinos y migran entre las células de la enfermera para alcanzar el ovocito en la parte posterior de la cámara de huevos 5,7. Este movimiento debe ser realizadomientras que las células permanecen en la frontera de un clúster que rodea dos células polares no móviles, haciendo de este un tipo de migración celular colectiva. Migración exitosa del grupo de células frontera garantiza el desarrollo adecuado de la micropilo de la cáscara del huevo, que es necesaria para la fertilización.
Las células polares anteriores instruyen destino celular frontera mediante la activación de una cascada de transducción de señales. Célula polar secretan una citoquina, Unpaired (UPD), que se une a un receptor transmembrana, domeless (DOMO), en células del folículo vecino durante la etapa 8 del desarrollo de los ovocitos 8,9. La unión de UPD causa de la tirosina quinasa Janus (JAK) para fosforilan el transductor de señales y activador de la transcripción (STAT) 8,10,11. STAT se mueve entonces al núcleo para activar la transcripción. Células del borde lento (SLBO) es un factor de transcripción que es una diana transcripcional directa de STAT y también se requiere para la migración de células frontera 12. Vistas laterales de cámaras de huevos indican tactividad STAT sombrero está regulada en un gradiente a través del epitelio anterior 8,11,13. Células del folículo más cercanos a las células polares tienen los más altos niveles de STAT activado, por lo que se convierten en células de frontera e invaden el tejido de la línea germinal adyacente.
Para entender cómo se especifican las células del borde interior y se desprenden del epitelio, tenemos que observar cómo se organiza el tejido. Si vemos cámaras de huevos desde una perspectiva anterior-en, esperaríamos la simetría radial de la actividad STAT en las células foliculares que rodean las células polares. Una vista frontal también mostrar con mayor precisión las diferencias de las proteínas de membrana y las interfaces de célula-célula antes y durante el desprendimiento de la comparación de células en diferentes planos focales. Porque cámaras de huevos son oblongas y unido entre sí por las células tallo, se instalan en portaobjetos lateralmente, por lo que es difícil de observar la arquitectura anterior. Por lo tanto, toda la información acerca de las células en los polos de la cámara de huevos tieneha inferido a partir de vistas laterales. Aunque alguna información puede ser obtenida a través de algoritmos reconstrucciones 3-D de las secciones ópticas, dispersión de la luz, fotoblanqueo y límites más pobres de la resolución en el eje Z que esta información menos detallada y fiable en ausencia de técnicas costosas como super-resolución microscopía 14 . Otros tipos de formación de imágenes basada en sección (por ejemplo, microscopía electrónica o seccionamiento microtomo) requieren una extensa manipulación de los tejidos, incluyendo la deshidratación, aumentando la probabilidad de artefactos. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo método para la imagen D. cámaras de huevos melanogaster mientras que en posición vertical. Este método ya ha demostrado su utilidad en la aclaración de cómo están destinados células móviles (ver resultados representativos y Manning et al, en revisión), y es probable que sea más ampliamente valiosa en el estudio de otros aspectos de la ovogénesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un método para montar y la imagen pequeña, el desarrollo de cámaras de huevos desde una perspectiva final sobre. Las técnicas comunes para cámaras de huevos de imagen se optimizan para las vistas laterales y permiten principalmente visualización precisa de las células del folículo medio-lateral cuando se tiñen con anticuerpos fluorescentes. El uso de la Z-pilas o 3-D ayudas reconstrucciones en la visualización de múltiples planos focales, pero sigue siendo insuficiente para la resolución su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O’Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14mL |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microknife | Roboz Surgical Instrument Company | 37-7546 | 45ᵒ angle |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60Wx15H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCL | IBI Scientific | IB70144 | 1M TRIS-HCL, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
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