Oppreist Imaging av<em> Drosophila</em> Egg Chambers
Summary
The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.
Abstract
Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.
Introduction
Studie av Drosophila melanogaster har gitt stor innsikt i den genetiske regulering av et bredt spekter av fenomener. Spesielt har det vært omfattende forskning på egg utvikling, fordi oogenesen gir en medgjørlig måte å undersøke mange ulike utviklingsprosesser, inkludert vev mønster, celle polaritetsskift, cellesyklus switching, og translasjonsforskning regulering 1,2,3,4. En viktig morphogenic hendelse i løpet oogenesen er spesifikasjonen, oppkjøp av motorisk uro og migrasjon av et sett med celler som kalles grenseceller (anmeldt i 5). Siden cellemigrasjon er en viktig funksjon i dyr morphogenesis, og fordi den genetiske reguleringen av denne prosessen er godt bevart, mekanismer fastsatt i fluer er sannsynlig å være viktig i andre sammenhenger. Dermed er vi undersøker den molekylære kontroll av grensen celle migrasjon. For våre studier, har vi utviklet en ny metode for å observere de fremre stolper for å utvikle egg,hvor grenseceller oppstår, for å undersøke hvordan de utvikler seg i detalj.
I eggstokken, egg kamre på ulike utviklingsstadier eksisterer sammen kjeder kalt ovarioles, som er innkapslet i en tynn slire (figur 1A). Hvert egg kammeret vil gå på å danne ett egg. Under oogenesen, må flere forskjellige celletyper utvikle seg på en koordinert måte. D. melanogaster egg kammeret består av 16 bakterie linjer celler, inkludert en eggcelle, omgitt av en ettlags follicular epitel 6. Et lite antall spesialiserte celler, kalles polare celler, oppstår på fremre og bakre polene på epitel. De 6-8 grensecellene stammer i fremre epitelet av egget kammeret, indusert av de polare celler 5,7. I midten av oogenesen (stadium 9), grense cellene løsner fra sine naboer og migrere mellom sykepleier cellene å nå eggcelle ved bakre av egget kammer 5,7. Denne bevegelsen må oppfyllesmens grense celler forblir i en klynge rundt to ikke-bevegelige polare celler, noe som gjør dette til en slags kollektiv celle migrasjon. Vellykket migrering av grensecelleklase sikrer riktig utvikling av micropyle av eggeskallet, som er nødvendig for befruktning.
Fremre polare celler instruere grensen celle skjebne ved å aktivere en signaltransduksjon kaskade. Polare celler utskiller et cytokin, Uparet (UPD), som binder til et transmembran reseptor, Domeless (DOME), på nabo hårsekkceller i trinn 8 av oocytt utvikling 8,9. Bindingen av UPD fører Janus tyrosin kinase (JAK) til phosphorylate Signal Svinger og Activator av transkripsjon (STAT) 8,10,11. STAT beveger seg deretter til kjernen for å aktivere transkripsjon. Langsomme Border Cells (SLBO) er en transkripsjonsfaktor som er en direkte transcriptional mål av STAT og er også nødvendig for grensen celle migrasjon 12. Sideutsikt over egg kamre indikere tlue STAT aktivitet er regulert i en gradient over fremre epitel 8,11,13. Hårsekkceller nærmest polar celler har de høyeste nivåene av aktivert STAT, og dermed blir de grense celler og invadere nabo bakterie-linje vev.
For å forstå hvordan grensecellene er spesifisert innenfor og løsner fra epitel, må vi observere hvordan vevet er organisert. Hvis vi ser på egg kamre fra en anterior-on perspektiv, ville vi forvente radial symmetri av STAT aktivitet i hårsekken celler som omgir de polare celler. Et enderiss ville også mer nøyaktig vise forskjeller i membranproteiner og celle-celle grensesnitt før og under løsgjøring enn å sammenligne celler i forskjellige fokalplan. Fordi egg kamre er avlange og er festet til hverandre ved hjelp av stengel-celler, de slå seg på objektglass i sideretningen, noe som gjør det vanskelig å observere den fremre arkitektur. Således har mye informasjon om cellene ved polene av egg kammeretblitt utledes fra sidevisninger. Selv om noen informasjon kan fås gjennom algoritmisk 3-D rekonstruksjoner av optiske seksjoner, lysspredning, fotobleking, og dårligere grensene for oppløsning i Z-aksen gjøre denne informasjonen mindre detaljert og pålitelig i fravær av dyre teknikker som super-oppløsning mikros 14 . Andre typer seksjon baserte avbildnings (for eksempel elektronmikroskopi eller mikrotom snitte) krever omfattende manipulering av vev, blant annet dehydrering, øker sannsynligheten for gjenstander. Dermed utviklet vi en ny metode for å image D. melanogaster egg kamre mens oppreist. Denne metoden har allerede vist seg nyttig i å belyse hvordan bevegelige celler er skjebne (se Representative resultater og Manning et al, under vurdering), og vil sannsynligvis være mer bredt verdifull i studier av andre aspekter av oogenesen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en fremgangsmåte for å montere og lite bilde, utvikle egg kamre fra en ende-mot perspektiv. Vanlige teknikker for bildebehandling egg kamre er optimalisert for sidevisninger og primært tillate presis visualisering av medio-lateral hårsekkceller når farget med fluorescerende antistoffer. Anvendelsen av Z-stabler eller 3-D-rekonstruksjoner hjelpemidler i å vise flere fokale plan, men er fremdeles utilstrekkelig for sub-cellulære oppløsning av polene på elliptiske egg kamre (figur 2D).</st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O’Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14mL |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microknife | Roboz Surgical Instrument Company | 37-7546 | 45ᵒ angle |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60Wx15H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCL | IBI Scientific | IB70144 | 1M TRIS-HCL, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
