Upprätt avbildning av<em> Drosophila</em> Egg Chambers
Summary
The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.
Abstract
Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.
Introduction
Studie av Drosophila melanogaster har lämnat stora insikter i den genetiska regleringen av ett brett spektrum av fenomen. Framför allt har det skett omfattande forskning om utveckling av ägg, eftersom oogenes ger en lätthanterlig sätt att undersöka många olika utvecklingsprocesser, bland annat vävnads mönstring, cell polaritet förändringar, cellcykel växling, och translationell reglering 1,2,3,4. En viktig morfogen händelse under oogenes är specifikationen, förvärv av motilitet, och migrering av en uppsättning celler som kallas gränsceller (granskas i 5). Eftersom cellmigration är en viktig del av djur morfogenes, och eftersom den genetiska regleringen av denna process är väl bevarad, mekanismer som bestäms i flugor är sannolikt viktiga i andra sammanhang. Således undersöker vi den molekylära kontrollen av gränscellmigration. För våra studier har vi utvecklat en ny metod för att observera de främre poler hos utveckla ägg,där gränsceller uppstår, för att undersöka hur de utvecklas i detalj.
Inom äggstocken, ägg kamrarna vid olika utvecklingsstadier existerar längs kedjor kallas ovarioles, vilka är inneslutna i en tunn mantel (Figur 1A). Varje ägg kammare kommer att gå på att bilda ett ägg. Under oogenes måste flera olika celltyper utvecklas på ett samordnat sätt. Den D. melanogaster ägg kammare består av 16 bakterielinjeceller, varav en äggcell, omgiven av ett enda lager follikulär epitel 6. Ett litet antal specialiserade celler, som kallas polära celler, uppstår vid de främre och bakre poler epitel. De 6-8 gränscellerna har sitt ursprung i den främre epitel av ägget kammaren, framkallad av polar cellerna 5,7. I mitten av oogenes (etapp 9), gränscellerna lossnar från sina grannar och migrera mellan sjuksköterska cellerna att nå äggcellen vid den bakre delen av ägget kammaren 5,7. Denna rörelse måste skemedan gränsceller kvar i ett kluster kring två icke-rörliga polära celler, vilket gör detta en typ av kollektiv migrationscell. Framgångsrik migrering av gränsen cellkluster säkerställer god utveckling av micropyle av äggskal, vilket är nödvändigt för befruktning.
De främre polära celler instruera gränscell öde genom att aktivera en signaltransduktion kaskad. Polära celler utsöndrar en cytokin, oparat (UPD), som binder till en transmembranreceptor, Domeless (Dome), på angränsande follikelceller under etapp 8 av oocytutveckling 8,9. Bindningen av UPD orsakar Janus tyrosinkinas (JAK) att fosforylera Signal Givare och Aktivator för transkription (STAT) 8,10,11. STAT flyttar sedan till kärnan att aktivera transkription. Slow Gräns Celler (SLBO) är en transkriptionsfaktor som är en direkt transkriptions mål på STAT och krävs också för gräns cell migration 12. Sidoutsikt över ägg kammare indikerar thatt STAT verksamhet är reglerad i en gradient över den främre epitelet 8,11,13. Follikelcellerna närmast de polära cellerna har de högsta nivåerna av aktiverad STAT, sålunda blir de gränsceller och invadera intilliggande grodd-linje vävnad.
För att förstå hur gränscellerna specificeras inom och lossas från epitel, behöver vi för att observera hur vävnaden är organiserad. Om vi ser på ägg kammare från en främre-on perspektiv skulle vi förvänta oss radiell symmetri STAT aktivitet i follikelcellerna omger polar cellerna. En ändvy skulle också mer exakt visa skillnader i membranproteiner och gränssnitt cell-cell före och under lossnar än att jämföra celler i olika fokalplan. Eftersom ägg kamrarna är avlånga och fästa till varandra genom stjälkceller, de sätter sig på diabilder i sidled, vilket gör det svårt att observera den främre arkitekturen. Således mycket information om cellerna vid polerna av ägget kammaren harvarit härledas från sidovyer. Även om viss information kan erhållas genom algoritm 3-D rekonstruktioner av optiska sektioner, ljusspridning, fotoblekning och fattigare gränser upplösning i Z-axeln göra denna information mindre detaljerade och tillförlitliga i avsaknad av dyra tekniker som superupplösning mikroskopi 14 . Andra typer av avsnitt baserad avbildning (t.ex. elektronmikroskopi eller mikrotom sektione) kräver omfattande manipulation av vävnader, inklusive uttorkning, vilket ökar sannolikheten för artefakter. Således har vi utvecklat en ny metod för att bilden D. melanogaster ägg kamrar medan upprätt. Denna metod har redan visat sig användbar för att belysa hur rörliga celler ödesbestämda (se Representativa resultat och Manning et al, under översyn), och kommer sannolikt att bli mer allmänt värdefulla i studier av andra aspekter av oogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en metod för att montera och bild liten, utveckla ägg kammare från en slut på perspektivet. Vanliga tekniker för avbildning ägg kammare är optimerade för sidovyer och främst möjliggöra exakt visualisering av medio-lateral follikelcellerna när färgas med fluorescerande antikroppar. Användningen av Z-stackar eller 3-D rekonstruktioner hjälpmedel i visnings flera fokalplan, men är fortfarande otillräckliga för sub-cellulära upplösning av polerna på elliptiska ägg kammare (Fig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O’Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14mL |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microknife | Roboz Surgical Instrument Company | 37-7546 | 45ᵒ angle |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60Wx15H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1M KPO4 Buffer |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCL | IBI Scientific | IB70144 | 1M TRIS-HCL, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
- Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
- Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
- Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).
- Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
- Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
- Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
- Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
- Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
- Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
- Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
- McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
- Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
- Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
- Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
- Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
- Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).
