Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Summary

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Abstract

Tijdens de ontwikkeling hematopoietische cellen ontstaan ​​uit een gespecialiseerde subset van endotheelcellen, hemogenic endotheel (HE). Modeling HE ontwikkeling in vitro is essentieel voor mechanistische studies van de endotheel-hematopoietische overgang en hematopoietische specificatie. Hier beschrijven we een werkwijze voor de efficiënte inductie van HE uit humane pluripotente stamcellen (hPSCs) door de overexpressie van verschillende sets van transcriptiefactoren. De combinatie van ETV2 en GATA1 of GATA2 TF wordt gebruikt voor HE induceren met pan-myeloïde potentieel, terwijl een combinatie van GATA2 en Tal1 transcriptiefactoren maakt de productie van HE met erythroïde en megakaryocytische potentieel. De toevoeging van LMO2 om GATA2 en Tal1 combinatie aanzienlijk versnelt differentiatie en verhoogt erytroïde en megakaryocytische cellen productie. Deze werkwijze verschaft een efficiënte en snelle manier van HE-inductie uit hPSCs en maakt de waarneming van de endotheel-hematopoietic overgang in een cultuur schotel. Het protocol bevat procedures hPSCs transductie en post-transductie analyse van HE en bloed voorlopers.

Introduction

Het unieke vermogen van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) om te hernieuwen en te differentiëren tot cellen van de drie kiembladen, met inbegrip van bloed, maken ze een waardevol instrument voor de mechanistische studies van hematopoietische ontwikkeling modellering van bloedziekten, drug screening, toxiciteit studies, en de ontwikkeling van cellulaire therapieën. Omdat de vorming van bloed in het embryo opbrengsten van hemogenic endotheel (HE) door een endotheliale hematopoietische overgang ^1,2, de opwekking van HE in culturen zou essentieel om de moleculaire mechanismen reguleren van de endotheelcellen aan hematopoietische overgang en hematopoietische specificatie te bestuderen. Huidige werkwijzen voor het onderzoeken van HE zijn gebaseerd op de inductie van differentiatie in hematoendothelial aggregaten (EBS) met toevoeging van hematopoïetische cytokinen ^5/3 en co-kweek van hPSCs met hematopoiese-ondersteunende stromale cellen ^6,7 of tweedimensionale kweken met extracellulaire matrices en cytokines ^8,9. Deze klassieke differentiatie methoden zijn gebaseerd op de introductie van externe signalen handelen op het celoppervlak en het initiëren van cascades van moleculaire mechanismen die uiteindelijk leiden tot de activering van transcriptie programma begeleiden hematoendothelial ontwikkeling. Derhalve de efficiëntie van hPSCs differentiaties in deze systemen is gebaseerd op een effectieve inductie van die signalen, signaaltransductie naar de kern en de resulterende activatie van specifieke transcriptiefactoren. Daarnaast is de studie van HE gebruikelijke differentiatie culturen vereist de extra stap van het isoleren van cellen met behulp HE celsortering. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor rechtstreekse inductie van HE en bloed door overexpressie van hematopoietische transcriptiefactoren. Deze werkwijze maakt een efficiënte inductie van HE in een schotel en directe observatie van de endotheliale hematopoietische overgang zonder de noodzaak van isolatie van HE via een omslachtige procedure celsortering.

Vorming van HE en bloed van humane pluripotente stamcellen efficiënt worden geïnduceerd door overexpressie enkele transcriptiefactoren (TF). De optimale combinatie van TFs kan induceren robuuste pan-myeloïde hematopoiese van hPSCs omvat ETV2 en GATA1 of GATA2. In tegenstelling, een combinatie van GATA2 en Tal1 induceert erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programmering hPSCs door de overexpressie van deze factoren onderscheidt hPSCs direct naar VE-cad ⁺ CD43 ^– CD73 ^– HE cellen die geleidelijk verwerven van de hematopoietische fenotype bepaald door de expressie van de vroege hematopoietische marker CD43 ^7. Deze lentivirale methode voor de rechtstreekse programmering van humane pluripotente stamcellen methode is toepasbaar voor het genereren van HE en bloedcellen voor mechanistische studies, studies van endotheliale hematopoietische overgang en transcriptieregulatie van hematopoietische ontwikkeling en specificatie. Hoewel de cUIDIGE protocol beschrijft bloedproductie via constitutieve expressie van de transgenen, soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen met gewijzigde mRNA ^10.

Protocol

1. Virus Preparaten en transcriptie Factor Combinaties Bereid oplossingen pSIN-EF1α lentivirale expressieplasmide bevattende eiwit-coderende DNA voor ETV2, GATA1, GATA2, Tal1 en LMO2 (tabel 1). Meet de concentratie en zuiverheid van plasmide-preparaten voor de productie van lentivirale opnemen UV absorptie met een spectrofotometer bij 230 nm, 260 nm en 280 nm. Opmerking: DNA-preparaten aantonen A260 / 280 en A260 / 230-waarden van meer dan 1,8 zijn over het algemeen beschouw…

Representative Results

Het schema van HE en bloed inductie van hPSCs door overexpressie van transcriptiefactoren wordt getoond in figuur 1. ETV2 met GATA1 of GATA2 combinatie induceert pan-myeloïde hematopoiese, terwijl een GATA2, Tal1 +/- LMO2 combinatie induceert hoofdzakelijk erythro-megakaryocyten hematopoiese. Beide TF combinaties direct geïnduceerde HE cellen die vervolgens omgezet in het bloed voorlopers met een duidelijke spectrum van hematopoietische differentiatie. Differentiatie van hPSCs van de pluripotente staa…

Discussion

De hierboven beschreven werkwijze voor hematopoëtische differentiatie van hPSCs door overexpressie van TFs, is een snelle en doeltreffende benadering voor het genereren van HE en myeloïde en erytho-magakaryocytic progenitoren hESCs en iPSCs, waardoor de productie van maximaal 30 miljoen bloedcellen 1 miljoen pluripotente stamcellen ^10. Deze methode tentoongesteld consistente differentiatie in meerdere hESC en iPSCs lijnen ^10. Tijdens de differentiatie door ETV2 en GATA2, GATA1 factoren evenals GA…

Materials

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.

pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins

Table 2. hPSCs culture.

Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation

Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.

Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ –>3’	Reverse (Rev) 5’–>3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	—	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	—	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	—	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	—	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	—	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	—	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region