Induzione diretta di Hemogenic endotelio e Sangue da sovraespressione di fattori di trascrizione in cellule staminali pluripotenti umane

Summary

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Abstract

Durante lo sviluppo, cellule ematopoietiche derivano da un sottoinsieme specializzato di cellule endoteliali, endotelio hemogenic (HE). Modellazione sviluppo HE in vitro è essenziale per gli studi meccanicistici della transizione endoteliale-ematopoietiche e le specifiche ematopoietiche. Qui, si descrive un metodo per l'induzione efficiente di SE da cellule umane pluripotenti staminali (hPSCs) mediante sovraespressione di diverse serie di fattori di trascrizione. La combinazione di ETV2 e GATA1 o GATA2 TF viene usato per indurre HE con potenziale pan-mieloide, mentre una combinazione di fattori di trascrizione e GATA2 TAL1 consente la produzione di HE con eritroide e potenziale megacariocitica. L'aggiunta di LMO2 a GATA2 e la combinazione TAL1 accelera notevolmente il differenziamento eritroide e aumenta e le cellule megacariociti produzione. Questo metodo fornisce un mezzo efficace e rapido di induzione HE da hPSCs e permette l'osservazione del endoteliale-hematopoietic transizione in un piatto di coltura. Il protocollo comprende le procedure hPSCs trasduzione e analisi post-trasduzione di SE e progenitori sangue.

Introduction

La capacità unica di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per auto-rinnovarsi e di differenziarsi in cellule di tre foglietti embrionali, compreso il sangue, li rendono uno strumento prezioso per gli studi meccanicistici di sviluppo ematopoietiche, la modellazione di malattie del sangue, lo screening di stupefacenti, studi di tossicità, e lo sviluppo di terapie cellulari. Perché la formazione del sangue nei proventi embrioni da endotelio hemogenic (HE) attraverso una transizione ematopoietiche endoteliale ^1,2, la generazione di SE nelle culture sarebbe essenziale per studiare i meccanismi molecolari che regolano la endoteliale transizione ematopoietiche e le specifiche ematopoietiche. Metodi attuali per studi di HE si basano sull'induzione di differenziazione hematoendothelial in aggregati (EBS) con l'aggiunta di citochine ematopoietiche ^3-5, e di co-coltura con cellule stromali hPSCs Emopoiesi-solidale ^6,7 o nelle culture bidimensionali con extracellulare matrici e cytokines ^8,9. Questi metodi di differenziazione classici si basano sull'introduzione di segnali esterni che agiscono sulla superficie cellulare e avvio cascate di percorsi molecolari che conducono alla attivazione del programma trascrizionale guidare lo sviluppo hematoendothelial. Quindi, l'efficienza di hPSCs differenziazioni in questi sistemi si basa su una induzione effettivo di questi segnali, la trasduzione del segnale al nucleo, e l'attivazione di specifiche risultante regolatori trascrizionali. Inoltre, lo studio di HE in colture di differenziazione convenzionali richiede l'ulteriore fase di isolare HE cellule usando separazione delle cellule. Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'induzione diretta di SE e sangue sovraespressione di fattori di trascrizione ematopoietiche. Questo metodo consente l'induzione efficiente HE in un piatto e osservazione diretta della endoteliale transizione ematopoietiche senza la necessità di isolamento di HE utilizzando una procedura di ordinamento cellule ingombrante.

Formazione di SE e del sangue da cellule staminali umane pluripotenti possono essere efficacemente indotti da iperespressione pochi fattori di trascrizione (TFS). La combinazione ottimale di TF in grado di indurre robusto emopoiesi pan-mieloide da hPSCs include ETV2 e GATA1 o GATA2. Al contrario, la combinazione di GATA2 e TAL1 induce erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programmazione hPSCs attraverso la sovraespressione di questi fattori differenzia hPSCs direttamente al VE-cad ⁺ CD43 ^– CD73 ^– HE cellule che acquisiscono gradualmente il fenotipo ematopoietiche definito mediante l'espressione dei primi ematopoietiche marcatore CD43 ^7. Questo metodo basato lentivirali-per la programmazione diretta del metodo di cellule staminali pluripotenti umane è applicabile per la generazione di HE e cellule del sangue per studi meccanicistici, studi di endoteliale di transizione ematopoietiche e regolazione trascrizionale di sviluppo ematopoietiche e le specifiche. Sebbene la cprotocollo orrente descrive la produzione di sangue usando l'espressione costitutiva dei transgeni, risultati simili possono essere ottenuti utilizzando modificato mRNA ^10.

Protocol

1. Preparativi Virus e fattore di trascrizione combinazioni Preparare soluzioni con PSIN-EF1α lentivirale plasmide di espressione contenente proteine ​​DNA codificante per ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 e LMO2 (Tabella 1). Misurare la concentrazione e la purezza dei preparati plasmide usato per la produzione lentivirale registrando assorbimento UV con uno spettrofotometro a 230 nm, 260 nm e 280 nm. Nota: Preparati DNA dimostrano A260 / 280 e A260 / 230 valori superiori a 1.8 s…

Representative Results

Lo schema di SE e induzione sangue da hPSCs di sovraespressione di fattori di trascrizione è mostrato in Figura 1. ETV2 con combinazione GATA1 o GATA2 induce emopoiesi pan-mieloide, mentre un GATA2, TAL1 +/- combinazione LMO2 induce emopoiesi prevalentemente eritro-megacariocitica. Entrambe le combinazioni TF direttamente indotto cellule HE che in seguito trasformati in progenitori di sangue con una gamma diversa di differenziazione ematopoietiche. Differenziazione delle hPSCs dallo st…

Discussion

Il metodo sopra descritto per ematopoietiche differenziazione hPSCs di sovraespressione di TF, rappresenta un metodo veloce ed efficace per la generazione di HE e mieloidi e erytho-magakaryocytic progenitori da hESC e iPSCs, consentendo in tal modo la produzione di fino a 30 milioni di cellule del sangue dal un milione di cellule staminali pluripotenti ^10. Questo metodo esposto differenziazione consistente in più di hESC e iPSCs ^linee 10. Durante differenziazione per ETV2 e GATA2, fattori GATA1 no…

Materials

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.

pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins

Table 2. hPSCs culture.

Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation

Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.

Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ –>3’	Reverse (Rev) 5’–>3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	—	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	—	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	—	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	—	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	—	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	—	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region