Summary

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

Published: December 03, 2015
doi:

Summary

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Abstract

במהלך פיתוח, תאי hematopoietic נובעים ממשנה מיוחד של תאי האנדותל, האנדותל hemogenic (HE). פיתוח מודלים הוא במבחנה הוא חיוני למחקרים מכניסטית של מעבר אנדותל-hematopoietic ומפרט hematopoietic. כאן, אנו מתארים שיטה לזירוז יעיל של HE מתאי אנושיים pluripotent גזע (hPSCs) בדרך של ביטוי יתר של קבוצות שונות של גורמי שעתוק. השילוב של ETV2 וGATA1 או GATA2 TFS משמש כדי לגרום לו עם פוטנציאל פאן-מיאלואידית, תוך שילוב של GATA2 וגורמי שעתוק TAL1 מאפשר לייצורו עם erythroid ופוטנציאל megakaryocytic. התוספת של LMO2 לGATA2 ושילוב TAL1 משמעותית מאיצה בידול ומגבירה את ייצור תאי erythroid וmegakaryocytic. שיטה זו מספקת אמצעי יעיל ומהיר של האינדוקציה HE מhPSCs ומאפשרת לתצפית של האנדותל-hematopoietiמעבר ג בצלחת תרבות. הפרוטוקול כולל נהלי התמרה hPSCs וניתוח שלאחר התמרה-שלו ואבות דם.

Introduction

היכולת הייחודית של תאי גזע pluripotent האנושיים (hPSCs) לעצמית לחדש ולהתמיין לתאים של שלוש השכבות נבט, כוללים דם, לגרום להם כלי רב ערך עבור המחקרים מכניסטית של פיתוח hematopoietic, מודלים של מחלות דם, הקרנת סמים, מחקרים רעילים, והפיתוח של טיפולים סלולריים. בגלל היווצרות דם בתמורת העובר מהאנדותל hemogenic (HE) דרך מעבר hematopoietic אנדותל 1,2, הדור של HE בתרבויות תהיה חיוני כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים המסדירים את המעבר לאנדותל hematopoietic ומפרט hematopoietic. שיטות נוכחי ללימודים של HE מבוססות על האינדוקציה של בידול hematoendothelial באגרגטים (EBS) עם התוספת של ציטוקינים hematopoietic 3-5, וcoculture של hPSCs עם תאי סטרומה hematopoiesis-תומך 6,7 או בתרבויות דו ממדים עם תאי מטריצות וגytokines 8,9. שיטות הבחנה הקלאסיות אלה מבוססות על ההיכרות של אותות חיצוניים הפועלים על פני השטח של התאים וייזום מפלי מסלולים מולקולריים שסופו של דבר יובילו להפעלה של תכנית תעתיק המנחה פיתוח hematoendothelial. לפיכך, את היעילות של בידול hPSCs במערכות אלה מסתמך על אינדוקציה יעילה של אותות אלה, הולכים אותות לגרעין, והפעלה של רגולטורי תעתיק ספציפיים וכתוצאה מכך. בנוסף, המחקר של HE בתרבויות בידול קונבנציונליים דורש צעד נוסף של בידוד HE תאים באמצעות מיון תא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזירוז הישיר שלו ודם על ידי ביטוי יתר של גורמי שעתוק hematopoietic. שיטה זו מאפשרת לאינדוקציה היעילה של HE בצלחת ותצפית ישירה של האנדותל למעבר hematopoietic ללא הצורך בבידוד של HE באמצעות הליך מיון תא מסורבל.

היווצרות הוא והדם מתאי גזע pluripotent אנושיים יכולים להיגרם ביעילות על ידי overexpressing רק כמה גורמי שעתוק (TFS). שילוב האופטימלי של TFS מסוגל גרימת hematopoiesis פאן-מיאלואידית החזקה מhPSCs כולל וGATA1 או GATA2 ETV2. לעומת זאת, שילוב של GATA2 וTAL1 גורם erythromegakaryocytopoiesis 10. תכנות hPSCs דרך ביטוי יתר של גורמים אלה מבדיל hPSCs ישירות לVE-CAD + CD43 CD73 – הוא תאים שירכשו את הפנוטיפ hematopoietic שהוגדר על ידי הביטוי של CD43 סמן hematopoietic מוקדם 7 בהדרגה. שיטה זו מבוססת על lentiviral לתכנות הישיר של שיטת תאי גזע pluripotent האנושית היא ישימה עבור הדור שלו ותאי דם למחקרים מכניסטית, מחקרים של האנדותל למעבר דם, ורגולצית תעתיק של פיתוח ומפרט hematopoietic. למרות גפרוטוקול urrent מתאר ייצור דם באמצעות ביטוי מכונן של transgenes, ניתן להשיג תוצאות דומות באמצעות mRNA שונה 10.

Protocol

1. הכנות וירוס וצירופי גורם שעתוק הכן את הפתרונות עם פלסמיד ביטוי lentiviral pSIN-EF1α מכיל DNA המקודדים חלבונים לETV2, GATA1, GATA2, TAL1 וLMO2 (טבלת 1). למדוד את הריכוז וטוהר הכנ?…

Representative Results

התרשים סכמטי של הוא ואינדוקצית דם מhPSCs ידי ביטוי יתר של גורמי שעתוק מוצג באיור 1. ETV2 עם שילוב GATA1 או GATA2 גורם hematopoiesis פאן-מיאלואידית, בעוד GATA2, TAL1 +/- שילוב LMO2 גורם hematopoiesis בעיקר erythro-megakaryocytic. שני שילובי TF ישירות מושרה תאיו שהפכו בהמשך לאבות דם עם ספקטרום שונה של ביד…

Discussion

השיטה מתוארת לעיל לבידול hematopoietic של hPSCs ידי ביטוי יתר של TFS, מייצגת גישה מהירה ויעילה לייצור הוא ואבות מיאלואידית וerytho-magakaryocytic מhESCs וiPSCs, ובכך לאפשר את ייצור תאי דם עד 30 מיליון מ תאי גזע pluripotent מיליון 10. שיטה זו הציגה בידול עקבי בקווי hESC וiPSCs מרובים 10. במהלך ביד…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.

Materials

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.

pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro  Addgene Plasmid #61061 Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro  Addgene Plasmid #61063 Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro  Addgene Plasmid #61062 Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro  Addgene Plasmid #61062 Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro  Addgene Plasmid #61064 Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)  Sigma-Aldrich 107689-10G Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302 RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A11105-01 Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation  WiCell Research Institute (Madison, WI) MCF Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb 
human SCF Peprotech 300-07 Premium grade
human TPO Peprotech 300-18 Research grade
human FGF-basic Peprotech 100-18B Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC BD Biosciences 560411 Endothelial marker (FACS)
CD226 PE BD Biosciences 338305 Hematopoietic (FACS)
CD43 PE BD Biosciences 560199 Hematopoietic (FACS)
CD73 APC R&D Systems FAB5795A Endothelial marker (FACS)
CD45 APC BD Biosciences 555485 Hematopoietic (FACS)
7AAD Life Technologies A1310 Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde  Sigma-Aldrich P6148-500G Cell fixation 
Triton X-100  Sigma-Aldrich T9284-500ML  Permeabilization 
FBS Fisher Scientific SH3007003 Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43 BD Biosciences 551457 Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin BenderMedSystem BMS158 Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated JacksonResearch 715-486-152 Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated JacksonResearch 715-516-150  Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain Life Technologies D1306  Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched STEMCELL Technologies 4435 CFC-assay
Wright Stain solution Sigma -Aldrich 32857 Staining cytospins

Table 2. hPSCs culture.

Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)  WiCell Research Institute (Madison, WI) hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media   WiCell Research Institute (Madison, WI) M500  Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel BD Biosciences/ Corning  356234 Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder  Life Technologies 12500-062 Basal Medium 
HyClone Dulbecco's PBS powder Fisher Scientific dSH30013.04 PBS
Dispase II, powder Life Technologies 17105-041 Neutral protease, Cell dissociation

Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.

Primer's Name Forward (Fwd)  5’ –>3’ Reverse (Rev) 5’–>3’ Discription 
pSIN EF1a Fwd TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA EF1a promoter sequence
GATA1 Rev TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC  Coding Region 
GATA2 Rev GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG  Coding Region 
TAL1 Rev AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT  Coding Region 
LMO2 Rev GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC  Coding Region 
ETV2 Rev GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC   Coding Region 

References

  1. Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
  2. Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
  3. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
  4. Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
  5. Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
  6. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
  7. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
  8. Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
  9. Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
  10. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
  11. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
  12. Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
  13. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).

Play Video

Cite This Article
Elcheva, I., Brok-Volchanskaya, V., Slukvin, I. Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (106), e52910, doi:10.3791/52910 (2015).

View Video