Summary

Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen

Published: December 03, 2015
doi:

Summary

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Abstract

Während der Entwicklung von einer Fachuntergruppe von Endothelzellen entstehen hämatopoetischen Zellen, hemogenic Endothel (HE). Modellierung HE Entwicklung in vitro ist für mechanistische Studien der endothelialen-hämatopoetischen Übergangs und blutbildenden Spezifikation. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die effiziente Induktion von HE aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) durch Überexpression von verschiedenen Sätzen von Transkriptionsfaktoren. Die Kombination von ETV2 und GATA1 oder GATA2 TFs wird verwendet, um die er mit pan-myeloischer Potential zu induzieren, während eine Kombination von GATA2 und TAL1 Transkriptionsfaktoren können zur Herstellung von SE mit erythroiden und megakaryozytischen Potential. Die Zugabe von LMO2 zu GATA2 und TAL1 Kombination wesentlich beschleunigt Differenzierung und erhöht erythroiden und Megakaryozyten-Zellen-Produktion. Dieses Verfahren stellt eine effiziente und schnelle Möglichkeit HE Induktion aus hPSCs und ermöglicht die Beobachtung des Endothel-hematopoietic Übergang in der Kulturschale. Das Protokoll enthält hPSCs Übertragungsverfahren und nach der Transduktion Analyse von HE und Blutvorläuferzellen.

Introduction

Die einzigartige Fähigkeit des menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sich selbst zu erneuern und sich in Zellen der drei Keimblätter, einschließlich Blut zu unterscheiden, machen sie ein wertvolles Werkzeug für die mechanistische Studien von hämatopoetischen Entwicklung, Modellierung von Blutkrankheiten, Wirkstoff-Screening, Toxizitätsstudien und die Entwicklung von Zelltherapien. Da die Blutbildung im Embryo Erlöse aus hemogenic Endothel (HE) durch eine endotheliale hämatopoetischen Gangs 1,2, die Erzeugung von HE in Kulturen wäre sehr wichtig, um die molekularen Mechanismen, die zur Regelung der Endothelzellen zu hämatopoetischen Übergangs und hämatopoetischen Spezifikation zu studieren. Derzeitigen Methoden für die Untersuchung der ER auf der Induktion von Differenzierung in hematoendothelial Aggregate (EVG) mit dem Zusatz von hämatopoetischen Cytokinen 3-5 und Cokultur hPSCs mit Hämatopoese-stützende Stromazellen 6,7 oder zweidimensionalen Kulturen mit extrazellulären basierend Matrizen und cytokines 8,9. Diese klassischen Differenzierung Methoden basieren auf der Einführung von Schauspiel an der Zelloberfläche und die Einleitung Kaskaden von molekularen Signalwege, die schließlich zur Aktivierung von Transkriptionsprogramm Führungs hematoendothelial Entwicklung führen externe Signale. Somit stützt sich der Wirkungsgrad hPSCs Differenzierungen in diesen Systemen auf einem effektiven Induktion von jenen Signalen, die Signaltransduktion in den Zellkern und die resultierende Aktivierung spezifischer Transkriptionsregulatoren. Darüber hinaus ist die Untersuchung von HE in herkömmlichen Differenzierungskulturen erfordert den zusätzlichen Schritt der Isolierung von HE-Zellen unter Verwendung der Zellsortierung. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die direkte Induktion von HE und Blut durch die Überexpression von hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren. Dieses Verfahren ermöglicht die effiziente Induktion HE in eine Schale und eine direkte Beobachtung der endothelialen hämatopoetische Übergang ohne die Notwendigkeit zur Isolierung von HE mit einem umständlichen Zellsortierungsverfahren.

Bildung HE und Blut von menschlichen pluripotenten Stammzellen können effizient durch Überexpression nur wenige Transkriptionsfaktoren (TFs) induziert werden. Die optimale Kombination von Transkriptionsfaktoren, die zur Induktion robust pan-myeloischer Blutbildung aus hPSCs umfasst ETV2 und GATA1 oder GATA2. Im Gegensatz dazu Kombination GATA2 und TAL1 induziert erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmieren hPSCs durch Überexpression dieser Faktoren unterscheidet hPSCs direkt an das VE-cad + CD43 CD73 HE Zellen, die stufenweise den hämatopoetischen Phänotyp durch Expression von frühen hämatopoetischen Marker CD43 7 definiert erhalten. Diese lentiviralen basierendes Verfahren für die direkte Programmierung der menschlichen pluripotenten Stammzellen Verfahren ist anwendbar zur Erzeugung von HE und Blutzellen für mechanistische Studien, Studien endothelialer hämatopoetische Übergang und transkriptionale Regulation der hämatopoetischen Entwicklung und Spezifikation. Obwohl der current Protokoll beschreibt die Blutbildung mit konstitutiver Expression der Transgene, könnten ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von modifizierten mRNA 10 erhalten werden.

Protocol

1. Viruspräparate und Transcription Factor Kombinationen Die Lösungen mit pSIN-EF1 lentiviralen Expressionsplasmid, das Protein-kodierende DNA für ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 und LMO2 (Tabelle 1). Messung der Konzentration und Reinheit von Plasmid-Präparationen durch die Aufzeichnung der UV-Absorption mit einem Spektrophotometer bei 230 nm, 260 nm und 280 nm für lentivirale Produktion verwendet. Hinweis: zeigen DNA-Präparationen A260 / 280 und A260 / 230-Werte größer als…

Representative Results

Die schematische Darstellung des HE und Blut Induktion aus hPSCs durch Überexpression von Transkriptionsfaktoren ist in Abbildung 1 ETV2 mit GATA1 oder GATA2 Kombination gezeigt, induziert pan-myeloischer Blutbildung, während ein GATA2, TAL1 +/- LMO2 Kombination induziert vorwiegend erythro-megakaryozytären Hämatopoese. Beide TF-Kombinationen direkt induzierte HE-Zellen, die anschließend in Blutvorläuferzellen mit einem ausgeprägten Spektrums von hämatopoetischen Differenzierung verwandelt. Diff…

Discussion

Das oben beschriebene Verfahren zur hämatopoetischen Differenzierung hPSCs durch Überexpression von TFs, stellt ein schnelles und effizientes Konzept für die Erzeugung von HE und myeloiden und erytho-magakaryocytic Progenitoren aus HES und iPSCs, wodurch die Produktion von bis zu 30 Millionen Blutzellen aus Million pluripotenten Stammzellen 10. Diese Methode zeigte konsequente Differenzierung in mehreren hESC und iPSCs Leitungen 10. Während der Differenzierung von ETV2 und GATA2, GATA1 Faktoren…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.

Materials

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.

pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro  Addgene Plasmid #61061 Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro  Addgene Plasmid #61063 Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro  Addgene Plasmid #61062 Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro  Addgene Plasmid #61062 Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro  Addgene Plasmid #61064 Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)  Sigma-Aldrich 107689-10G Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302 RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A11105-01 Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation  WiCell Research Institute (Madison, WI) MCF Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb 
human SCF Peprotech 300-07 Premium grade
human TPO Peprotech 300-18 Research grade
human FGF-basic Peprotech 100-18B Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC BD Biosciences 560411 Endothelial marker (FACS)
CD226 PE BD Biosciences 338305 Hematopoietic (FACS)
CD43 PE BD Biosciences 560199 Hematopoietic (FACS)
CD73 APC R&D Systems FAB5795A Endothelial marker (FACS)
CD45 APC BD Biosciences 555485 Hematopoietic (FACS)
7AAD Life Technologies A1310 Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde  Sigma-Aldrich P6148-500G Cell fixation 
Triton X-100  Sigma-Aldrich T9284-500ML  Permeabilization 
FBS Fisher Scientific SH3007003 Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43 BD Biosciences 551457 Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin BenderMedSystem BMS158 Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated JacksonResearch 715-486-152 Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated JacksonResearch 715-516-150  Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain Life Technologies D1306  Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched STEMCELL Technologies 4435 CFC-assay
Wright Stain solution Sigma -Aldrich 32857 Staining cytospins

Table 2. hPSCs culture.

Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)  WiCell Research Institute (Madison, WI) hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media   WiCell Research Institute (Madison, WI) M500  Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel BD Biosciences/ Corning  356234 Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder  Life Technologies 12500-062 Basal Medium 
HyClone Dulbecco's PBS powder Fisher Scientific dSH30013.04 PBS
Dispase II, powder Life Technologies 17105-041 Neutral protease, Cell dissociation

Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.

Primer's Name Forward (Fwd)  5’ –>3’ Reverse (Rev) 5’–>3’ Discription 
pSIN EF1a Fwd TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA EF1a promoter sequence
GATA1 Rev TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC  Coding Region 
GATA2 Rev GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG  Coding Region 
TAL1 Rev AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT  Coding Region 
LMO2 Rev GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC  Coding Region 
ETV2 Rev GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC   Coding Region 

References

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Cite This Article
Elcheva, I., Brok-Volchanskaya, V., Slukvin, I. Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (106), e52910, doi:10.3791/52910 (2015).

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