This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.
Under utveckling, hematopoietiska celler härrör från en specialiserad delmängd av endotelceller, hemogenic endotel (HE). Modellering HE utveckling in vitro är avgörande för mekanistiska studier av endotel-hematopoetisk övergång och hematopoetisk specifikation. Här beskriver vi en metod för effektiv induktion av HE från humana pluripotenta stamceller (hPSCs) genom överuttryck av olika uppsättningar av transkriptionsfaktorer. Kombinationen av ETV2 och GATA1 eller GATA2 TF: används för att inducera HE med pan-myeloid potential, medan en kombination av GATA2 och TAL1 transkriptionsfaktorer medger framställning av HE med erytroida och megakaryocytisk potential. Tillsatsen av LMO2 till GATA2 och TAL1 kombination väsentligen accelererar differentiering och ökar erytroida och megakaryocytiska celler produktion. Denna metod ger ett effektivt och snabbt sätt att HE induktion från hPSCs och möjliggör observation av endotel-hematopoietic övergång i en odlingsskål. Protokollet inkluderar procedurer hPSCs överföring och efter transduktion analys av HE och blod stamceller.
Den unika förmågan hos humana pluripotenta stamceller (hPSCs) att själv förnya och att differentiera till celler av de tre groddblad, inklusive blod, gör dem till ett värdefullt verktyg för mekanistiska studier av hematopoetiskt utveckling, modellering av blodsjukdomar, läkemedelsscreening, toxicitetsstudier, samt utveckling av cellulära terapier. Eftersom blodbildningen i embryot intäkterna från hemogenic endotel (HE) genom en endothelial hematopoetisk övergång 1,2, skulle generering av HE i kulturer vara avgörande för att studera de molekylära mekanismer som reglerar endotel till hematopoetisk övergång och hematopoetisk specifikation. Aktuella metoder för studier av HE är baserade på induktion av hematoendothelial differentiering i aggregat (EBS) med tillägg av hematopoietiska cytokiner 3-5, och samodling av hPSCs med Blodbildning-stödjande stromaceller 6,7 eller i två-dimensionella odlingar med extracellulärt matriser och cytokines 8,9. Dessa klassiska differentiering metoder är baserade på införandet av externa signaler som verkar på cellytan och initiera kaskader av molekylära vägar som så småningom leder till aktivering av transkriptions program vägledande hematoendothelial utveckling. Sålunda effektivitet hPSCs indelningar i dessa system förlitar sig på en effektiv induktion av dessa signaler, signaltransduktion till kärnan, och den resulterande aktivering av specifika transkriptionsregulatorer. Dessutom har studier av HE i konventionella differentieringsodlingar kräver det ytterligare steget att isolera HE celler med användning av cellsortering. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för direkt induktion av HE och blod genom överexpression av hematopoietiska transkriptionsfaktorer. Denna metod möjliggör effektiv induktion av HE i en skål och direkt observation av den endoteliala hematopoietiska övergång utan behov av isolering av HE med användning av en besvärlig cellsorteringsproceduren.
Bildning av HE och blod från humana pluripotenta stamceller kan effektivt induceras genom överuttryck bara några transkriptionsfaktorer (TFS). Den optimala kombinationen av TF kan inducera robusta pan-myeloid hematopoies från hPSCs inkluderar ETV2 och GATA1 eller GATA2. I motsats, en kombination av GATA2 och TAL1 inducerar erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmering hPSCs genom överuttryck av dessa faktorer skiljer hPSCs direkt till VE-cad + CD43 – CD73 – HE celler som gradvis förvärva hematopoetisk fenotyp definieras genom uttrycket av tidiga hematopoetiska markör CD43 7. Detta lentiviral-baserad metod för direkt programmering av mänskliga pluripotenta stamceller metod är tillämplig för generering av HE och blodceller för mekanistiska studier, studier av endotel hematopoietiska omvandlingar och transkriptionsreglering av hematopoetisk utveckling och specifikation. Även om cktuellt protokoll beskriver produktion blod med användning av konstitutiv expression av transgenerna, liknande resultat kan erhållas med användning av modifierat mRNA 10.
Den ovan beskrivna metoden för hematopoetisk differentiering av hPSCs genom överuttryck av TF representerar en snabb och effektiv metod för generering av HE och myeloid och erytho-magakaryocytic stamceller från hESCs och iPSCs, varigenom produktion av upp till 30 miljoner blodkroppar från en miljon pluripotenta stamceller 10. Denna metod uppvisade konsekvent differentiering i flera hESC och iPSCs linjerna 10. Under differentiering av ETV2 och GATA2, GATA1 faktorer samt GATA2 och TAL1 faktorer …
The authors have nothing to disclose.
We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture.
Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ –>3’ | Reverse (Rev) 5’–>3’ | Discription |
pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | — | EF1a promoter sequence |
GATA1 Rev | — | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
GATA2 Rev | — | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
TAL1 Rev | — | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
LMO2 Rev | — | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
ETV2 Rev | — | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |