Utilisation de cellules Caco-2 à étudier Lipid Transport par l'intestin
Summary
Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.
Abstract
Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).
Introduction
Des études sur l'absorption intestinale des graisses alimentaires, les médicaments et les vitamines et solubles dans les lipides peuvent être conduites in vivo en utilisant un modèle de la fistule lymphatique 1-4. Cependant, les techniques chirurgicales sont impliqués non seulement difficile, mais aussi coûteux. Bien que in vivo approches basées sur l'analyse des fèces peuvent être utilisés, ils sont principalement utilisés pour déterminer l'absorption pour cent par le tractus gastro-intestinal 2,5. Le modèle in vitro décrit dans le présent document est plus rentable, et les techniques impliquées sont sans doute moins difficile. Des études de modification génétique sont également plus économique et moins de temps lorsqu'ils sont effectuées en utilisant ce modèle in vitro.
Depuis matières solubles dans les lipides qui sont prises par les entérocytes sont emballés dans les lipoprotéines 6,7, l'efficacité de ce modèle in vitro pour produire des lipoprotéines est crucial. Les deux intestina principalel lipoprotéines sont chylomicrons et les lipoprotéines de très faible densité (VLDL). Les chylomicrons, lipoprotéines définies comme ayant 80 nm ou plus de diamètre, sont fabriqués strictement par l'intestin grêle quand lipides sont présents en abondance dans la lumière gastro-intestinale. Comme ils sont les plus grands lipoprotéines, chylomicrons sont vraisemblablement les transporteurs de lipides les plus efficaces. Ce modèle in vitro, qui est capable de produire des chylomicrons 8, peut être utilisé pour étudier l'absorption de graisse alimentaire, la vitamine liposoluble absorption par l'intestin, et la biodisponibilité orale du médicament lipophile. La présence de molécules solubles dans les lipides, des vitamines, des médicaments ou dans la fraction de lipoprotéine est un indicateur de leur absorption par l'intestin grêle. Comme indiqué précédemment, ce modèle peut être utilisé pour améliorer la biodisponibilité des médicaments par voie orale lipophile 6.
Ce document décrit comment cellules Caco-2 devraient être maintenus dans la membrane perméable ou plats réguliers de culture de tissus, la façon dont les mi lipidiquesxture pour stimuler la production de lipoprotéines doit être préparé, la façon dont le système d'expression de lentivirus peut être utilisé pour réaliser une surexpression efficace, et la façon dont les lipoprotéines isolées doit être analysé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce document, les deux systèmes qui peuvent être utilisés pour maintenir les cellules Caco-2 sont décrits, à savoir, la boîte de culture de tissu normal et la membrane perméable. Les avantages de l'utilisation du système de membrane perméable comprend la séparation de la apical et basolatéral des compartiments, et la capacité à incuber le mélange de lipides et de recueillir la sécrétion des lipoprotéines en même temps. Cependant, les inserts de membrane perméable sont chers, et leur membrane e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Seed Grant Award from California Northstate University College of Pharmacy (to AMN). The authors would like to thank California Northstate University College of Pharmacy for covering the publication cost of this article, and George Talbott for his help in editing this manuscript.
Materials
| DMEM | VWR | 16750-112 | Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells |
| FBS | Fisher | 3600511 | We do not heat inactivate our serum |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment |
| Permeable membrane system | Fisher | 7200173 | 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane |
| 10 cm dish | Fisher | 08-772-E | Tissue culture dish |
| 15 cm dish | Fisher | 08-772-24 | Tissue culture dish |
| 24 well plate | Fisher | 12565163 | Tissue culture plate |
| Lipid-based transfection reagent | Fisher | PRE2691 | Can be substituted with other transfection reagent |
| Reduced serum media | Invitrogen | 11058021 | For transfection |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Bottle-top filter | Fisher | 9761120 | 0.45 mm pore |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/mL |
| Oleic acid | Sigma | 01383-5G | Prevent freeze-thaw cycle |
| Lecithin | Fisher | IC10214625 | Egg lecithin |
| Sodium taurocholate | Fisher | NC9620276 | Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956 |
| Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) | Fisher | 5892791001 | Used mainly for samples that need TEM analysis |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Fisher | NC9696153 | Reusing it multiple times will collapse the tube |
| Lid for ultracentrifuge tube | Fisher | NC9796914 | A tool is required to remove the tube/lid from rotor |
| Syringe | Fisher | 50-949-261 | Disposable |
| Syringe filter | Fisher | 09-719C | Pore size = 0.2 mm; nylon |
| Phosphotungstic acid | Fisher | AC208310250 | For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0 |
| Tweezer | Fisher | 50-238-62 | Extra fine and strong tips |
| Formvar/carbon grid | Fisher | 50-260-34 | Formvar/carbon film square grid 400 Copper |
References
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