소장에 의해 지질 전송을 연구하기 위해 카코 2 셀을 사용하여
Summary
Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.
Abstract
Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).
Introduction
4 -식이 지방과 지용성 약물과 비타민의 장내 흡수 연구는 림프 누공 모델 1을 사용하여 생체 내에서 수행 할 수있다. 그러나 관련된 수술 기법은 도전뿐만 아니라 비용이 많이 드는되지 않습니다. 생체 이용 될 수 분변 분석에 기반 방식이지만, 이들은 위장관 2,5- 의해 흡수 퍼센트를 결정 주로 사용된다. 이 문서에 설명 된 체외 모델은 비용 효과적이며, 관련 기술은 틀림없이 덜 도전이다. 유전자 변형 연구는 시간이 많이 걸리는 사람들이 체외 모델을 사용하여 수행 할 때 더 경제적이고 저렴합니다.
장 세포에 의해 흡수되는 지용성 물질 지단백질 -6,7-로 포장되어 있기 때문에, 리포 단백질을 생산하기 위해이 시험 관내 모델의 효과는 매우 중요하다. 두 가지 주요 intestinaL 지단백질은 카일로 마이크론과 매우 저밀도 지단백질 (VLDL)입니다. 지질은 위장 루멘에 풍부하게 존재하는 경우 직경이 80 nm 이상과 지질 단백질로 정의 카일로 마이크론은, 소장에 의해 엄격하게 생산된다. 그들이 가장 큰 지단백질이기 때문에, 카일로 마이크론은 생각할 가장 효율적인 지질 수송이다. 킬로 미크론 (8)을 제조 할 수있는 이러한 시험 관내 모델은,식이 지방 흡수에 의한 소화관 지용성 비타민의 흡수 및 지용성 약물 경구 생체 이용률을 연구하는데 사용될 수있다. 지단백질 분획에 지용성 분자, 비타민, 또는 약물의 존재는 소장 흡수하여 자신의 지표이다. 전술 한 바와 같이,이 모델은 경구 지용성 약물 생체 이용율 (6)을 향상 시키는데 사용될 수있다.
이 논문은 카코 2 세포 투과 막 또는 일반 조직 배양 접시, 어떻게 지질 마일에서 유지되어야한다 방법을 설명합니다지질 단백질 생산을 자극 xture는 렌티 바이러스 발현 시스템이 효율적인 과발현을 달성하기 위해 이용 될 수있는 방법을 준비해야하며, 절연 지단백질은 어떻게 분석되어야한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 논문에서는 사용될 수 개의 시스템 카코 -2 세포, 즉, 정규 조직 배양 접시 투과 막을 기재되어 유지한다. 투과성 막 시스템을 사용할 때의 이점은 정점의 분리 및 기저 외측 구획하고, 지질 혼합물을 배양하는 동시에 지단백질 분비를 수집하는 기능을 포함한다. 다만, 투과 막 인서트 비싸고, 그 폴리 카보네이트 막 좋은 셀 가시성을 허용하지 않는다. 이 시험 관내 모델의 장점 중 하나는…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Seed Grant Award from California Northstate University College of Pharmacy (to AMN). The authors would like to thank California Northstate University College of Pharmacy for covering the publication cost of this article, and George Talbott for his help in editing this manuscript.
Materials
| DMEM | VWR | 16750-112 | Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells |
| FBS | Fisher | 3600511 | We do not heat inactivate our serum |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment |
| Permeable membrane system | Fisher | 7200173 | 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane |
| 10 cm dish | Fisher | 08-772-E | Tissue culture dish |
| 15 cm dish | Fisher | 08-772-24 | Tissue culture dish |
| 24 well plate | Fisher | 12565163 | Tissue culture plate |
| Lipid-based transfection reagent | Fisher | PRE2691 | Can be substituted with other transfection reagent |
| Reduced serum media | Invitrogen | 11058021 | For transfection |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Bottle-top filter | Fisher | 9761120 | 0.45 mm pore |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/mL |
| Oleic acid | Sigma | 01383-5G | Prevent freeze-thaw cycle |
| Lecithin | Fisher | IC10214625 | Egg lecithin |
| Sodium taurocholate | Fisher | NC9620276 | Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956 |
| Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) | Fisher | 5892791001 | Used mainly for samples that need TEM analysis |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Fisher | NC9696153 | Reusing it multiple times will collapse the tube |
| Lid for ultracentrifuge tube | Fisher | NC9796914 | A tool is required to remove the tube/lid from rotor |
| Syringe | Fisher | 50-949-261 | Disposable |
| Syringe filter | Fisher | 09-719C | Pore size = 0.2 mm; nylon |
| Phosphotungstic acid | Fisher | AC208310250 | For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0 |
| Tweezer | Fisher | 50-238-62 | Extra fine and strong tips |
| Formvar/carbon grid | Fisher | 50-260-34 | Formvar/carbon film square grid 400 Copper |
References
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