تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية
Summary
Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.
Abstract
قمنا بتطوير منصة الفحص لتحديد مخصصة تحركات البروتينات البشرية للركائز فسفرته والتي يمكن استخدامها لتوضيح رواية مسارات نقل الإشارة. نهجنا ميزات استخدام مكتبة تنقية الموسومة GST تحركات البروتينات البشرية وركيزة البروتين المؤتلف من الاهتمام. وقد استخدمنا هذه التكنولوجيا لتحديد MAP / أنيبيب التنظيم تقارب كيناز 2 (MARK2) كما كيناز لموقع التنظيم الجلوكوز على الخاضعة للرقابة CREB الترانسكربتي Coactivator 2 (CRTC2)، وهو بروتين اللازم لتكاثر الخلايا بيتا، وكذلك الأسرة AXL التيروزين كيناز كما المنظمين من ورم خبيث الخلية عن طريق الفسفرة من البروتين محول ELMO. وصفنا هذه التكنولوجيا ومناقشة كيف يمكن أن يساعد على وضع خريطة شاملة لكيفية استجابة الخلايا للمؤثرات البيئية.
Introduction
البروتين التعديلات بعد متعدية (PTMs) ضرورية للتواصل بين الخلايا. ولعل أفضل درس لجميع PTMs هو الفسفرة، يحفزه تحركات البروتينات، التي تنظم عدد لا يحصى من وظائف البروتين، بما في ذلك نشاطهم الكيمياء الحيوية، وتوطين التحت خلوية، التشكل، والاستقرار. تحديد المواقع الفسفرة على البروتينات الهدف يمكن تحقيقه عن طريق التعيين phosphopeptide زيتية أو عن طريق تقنيات البروتين الآن القياسية باستخدام عينات المخصب لالببتيدات فسفرته 1،2. في حين من المتوقع أن يتم فسفرته 3 ثلاثة أرباع بروتيوم أعرب وحددت 200،000 مواقع الفسفرة 5، مع تقديرات تصل إلى 1000000 6، وكثير من هؤلاء ليس لهم علم الأحياء المخصصة، مما يشير إلى مسار أو بروتين كيناز.
في حين تحديد المواقع فسفرته واضح ومباشر نسبيا، تحديا أكبر نسبيا هوتحديد كيناز وما شابه ذلك (ق) التي تستهدف هذه المواقع، وهي عملية نطلق عليه رسم الخرائط كيناز: أزواج الركيزة. عدة طرق لتحديد كيناز: وقد وصفت أزواج الركيزة، إما بدءا من كيناز من الفائدة وتبحث عن ركائز، أو بدءا ركيزة من الاهتمام ومحاولة لإيجاد كيناز المعدلة تجريبيا 11/07 أو حسابيا 12. لتحديد تحركات لالركيزة فسفرته معروف، المعلوماتية الحيوية يمكن استخدامها لتحديد البروتينات التي تحتوي على تسلسل الحفظ قصيرة من الأحماض الأمينية المرافقة بقايا فسفرته (موقع الإجماع)، فضلا عن تحديد تحركات التي تشكل مجمع precipitable مع الركيزة. ومع ذلك، هذه الأساليب هي مضيعة للوقت، وغالبا ما لا تفي بالنجاح.
قمنا بتطوير نهج وظيفي منتظم لتحديد بسرعة تحركات التي يمكن أن الفوسفات ركيزة معينة (13). فحص الشاشة تنتج تحديدا ممتازإيتي، مع اختيار واضحة جدا لتحركات المشابهة المحتملة. ونظرا لمركزية الفسفرة إلى الإشارات البيولوجية، والشاشة هي مفيدة لاكتشاف خلية تقريبا في جميع مسارات إشارات 14-16. ينطوي على الشاشة إجراء فحص كيناز على نطاق واسع مع مكتبة من تحركات البروتينات البشرية. تم الموسومة تحركات مع الجلوتاثيون البكتيرية S-ترانسفيراز (GST) البروتين وتنقيته من مقتطفات خلايا الثدييات، وهو ما يعني أن الإنزيمات المؤتلف – على عكس تلك التي أعدت من البكتيريا – تتولد في وجود تحركات البروتينات المنبع في كثير من الأحيان اللازمة ل الانزيمات المؤتلف أن يكون النشاط في المختبر. في الواقع، في حين سيرين، ثريونين، والتيروزين النشاط كيناز اللازمة لتفعيل كيناز المصب الموجودة في الخميرة 10، الجينوم الخميرة بترميز 122 تحركات البروتينات، مشيرا إلى أن kinome الثدييات، مع أكثر من 500 جين 17، أصبحت أكبر بكثير من مجمع ل العاديهالشركة المصرية للاتصالات العمليات الفريدة للكائنات العليا. وعلاوة على ذلك، فإن تأثير المحفزات المختلفة ذات الصلة لبيولوجيا الخلية والأمراض التي تصيب البشر (مثل الجزيئات الصغيرة، عوامل النمو والهرمونات وغيرها) يمكن أن تستخدم ل14،15 تعدل النشاط كيناز في سياق مناسب.
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ المنشورات الأصلية واصفا نهج 14،15، تم توسيع المكتبة الأصلي من 180 GST-تحركات إلى 420 عضوا، أو ~ 80٪ من kinome البروتين البشري. مع مكتبة الموسعة، البروتوكول كما هو موضح يستغرق 4-5 أيام ثم 1-4 أيام لتطوير الأفلام (بحسب ما تقتضيه الضرورة)، والتي يمكن اختصارها عن طريق استخدام …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق منح NSERC 386634. ونود أن نشكر أعضاء مختبر Screaton لإجراء مناقشات مفيدة.
Materials
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 uL) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 uL) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 mL) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2X SDS lysis buffer (100 mL) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation–a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. . Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature’s Inventory. , (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
