높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별
Summary
Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.
Abstract
우리는 새로운 신호 전달 경로를 밝히기 위해 사용될 수 인산화 기판 전용 인간 단백질 키나제를 식별하기위한 스크리닝 플랫폼을 개발했다. 우리의 접근 방식은 정제 GST – 태그 인간의 단백질 키나아제의 라이브러리와 관심의 재조합 단백질 기판의 사용을 특징으로한다. 우리는, CREB-규제 전사 보조 활성화 인자 2 (CRTC2)에 글루코스 조절 사이트 키나아제 MAP / 미세 소관 연관 조절 키나제 2 (MARK2)를 식별하는 베타 세포의 증식에 필요한 단백질뿐만 아니라을이 기술을 사용한 티로신의 액슬 제품군은 어댑터 단백질 엘모의 인산화에 의한 세포 전이의 규제로 키나아제. 우리는이 기술을 설명하고 세포가 환경 자극에 반응하는 방법의 포괄적 인지도를 구축하는 데 도움이 될 수 있습니다 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
단백질 번역 후 변형 (PTMS)는 세포 내 통신을위한 필수적이다. 아마도 모든 PTMS의 연구 최고 세포 내 현지화, 형태, 안정성, 생화학 적 활동을 포함한 단백질 기능의 무수를 조절 단백질 인산화 효소에 의해 촉매 인산화이다. 표적 단백질의 인산화 부위의 식별은 트립신 포스 포 매핑 또는 인산화 펩티드 1,2- 위해 농축 된 샘플을 이용하여 현재 표준 프로테옴 기법에 의해 달성 될 수있다. 발현 프로테옴 사분의 삼가 3 인산화 될 것으로 예상하고 100 만 6까지 예상치 200,000 인산화 부위 5를 식별하는 동안, 이들의 대부분은 통로 또는 단백질 키나제 시그널링 어떠한 할당 생물학 없다.
인산화 사이트의 식별은 비교적 큰 도전이고, 비교적 간단하지만기판 쌍 :이 사이트를 대상으로 동족 키나제 (들), 우리가 매핑 키나제로 참조하는 프로세스를 식별합니다. 기판 쌍이 설명되었지만, 어느 주목 키나아제로 시작하고 그 기판을 찾고 관심 또는 기판에서 시작하여 개질 키나아제 7-11 또는 실험적 계산 (12)을 찾기 위해 시도 : 키나아제를 식별하기위한 여러 가지 방법. 공지 인산화 기판 키나제를 식별하는, 생물 정보학 기판과 강수량 복합체를 형성 키나제 인산화 잔사 (컨센서스 사이트) 측면뿐만 아니라 식별 아미노산의 짧은 보존 된 서열을 포함하는 단백질을 식별하는 데 사용될 수있다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되어 종종 성공을 충족하지 않습니다.
우리는 주어진 빠르게 기판 (13)을 인산화 키나아제를 식별 체계적인 접근 기능을 개발 하였다. 스크린 분석법 우수한 특정을 생산잠재적 인 동족 키나제에 대한 아주 명확한 선택과 성만. 생물학적 신호에 인산화의 중심성을 감안할 때, 스크린은 거의 모든 세포 신호 전달 경로 14-16에서 발견에 유용합니다. 스크린은 인간 단백질 키나제의 라이브러리로 대규모 키나아제 분석을 수행하는 것을 포함한다. 키나아제는 박테리아 글루타치온 S 트랜스퍼 라제 (GST) 단백질로 태그 된 재조합 효소 즉, 포유 동물 세포 추출물로부터 정제 – 박테리아로부터 제조 된 것과 달리 – 종종 필요한 상류 단백질 키나제의 존재하에 생성되고 재조합 효소는 시험 관내에서 활성을 갖는. 세린, 트레오닌 및 티로신 키나제 활성이 하류 키나제 활성화에 필요하면서 실제로 효모 (10)에 존재하는, 효모 게놈은 500 유전자 17 포유류 kinome는,하기 위해 훨씬 더 복잡해질 것을 나타내는, 122 단백질 키나제를 코딩 REGULA고차 생물에 고유의 프로세스를 테. 또한, 세포 생물학 및 (등과 소분자, 성장 인자, 호르몬 등) 인간의 질병과 관련된 다른 자극의 효과는 적절한 컨텍스트 (14, 15)는 조절 키나제 활성에 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
14,15 접근법을 설명 원래 공보 이후, 180 GST-키나제의 원래 라이브러리는 인간 단백질 kinome 420 부재, 또는 ~ 80 %로 확대되었다. 확장 된 라이브러리와 같은 설명 프로토콜 (필요하다고 인정하는) phosphorimaging 및 디지털 신호 향상의 사용에 의해 단축 될 수있는 필름을 개발 4~5일 다음 1~4일 걸립니다. 주의를 기울여야합니다 몇 가지 주요 단계 (프로토콜의 개요를 그림 1 참조)이 있…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NSERC 부여에 의해 지원되었다 386634. 우리는 도움이 토론 Screaton 연구소의 회원들에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 uL) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 uL) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 mL) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2X SDS lysis buffer (100 mL) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
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