ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定
Summary
Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.
Abstract
我々は、新規のシグナル伝達経路を解明するために使用することができ、リン酸化基質のための専用のヒトプロテインキナーゼを同定するためのスクリーニングプラットフォームを開発しました。我々のアプローチは、精製GSTタグ付きヒトプロテインキナーゼのライブラリーを使用すると、目的の組換えタンパク質基質を備えています。私たちは、CREB-規制転写コアクチベーター2（CRTC2）のグルコース調節サイトのキナーゼとしてのMAP /微小管親和性調節キナーゼ2（MARK2）を識別するために、β細胞の増殖に必要なタンパク質、ならびにこの技術を使用していますアダプタータンパク質ELMOのリン酸化による細胞の転移の調節因子としてのチロシンキナーゼのAXLファミリー。私たちはこの技術を記述し、それは、細胞が環境刺激に応答する方法の包括的なマップを確立するのを助けることができる方法について説明します。
Introduction
タンパク質の翻訳後修飾（PTMを）は、細胞内の通信のために不可欠です。おそらく全てのPTMの検討最高の細胞内局在性、コンフォメーション、安定性、それらの生化学的活性を含むタンパク質の機能の無数を調節するタンパク質キナーゼによって触媒されるリン酸化は、です。標的タンパク質上のリン酸化部位の同定は、トリプシンリンペプチドマッピングにより、またはリン酸化ペプチド1,2-について富化サンプルを使用して、今、標準プロテオミクス技術によって達成することができます。表現プロテオームの四分の三が3リン酸化されることが予想され、100万6までの推計で20万リン酸化部位5を特定しているが、これらの多くは、経路、またはプロテインキナーゼシグナル伝達、全く割り当てられた生物学を持っていません。
リン酸化部位の同定は比較的簡単ですが、比較的大きな挑戦はにあります基板のペア：これらのサイトを対象と同族キナーゼ（複数可）、我々はマッピングキナーゼと呼ぶプロセスが識別されます。いくつかのキナーゼを同定するための方法：基板対は、目的のキナーゼで開始し、その基質を探しまたは対象の基板から始まると修飾キナーゼ実験7-11または計算12を検索しようとするいずれかの記載されています。既知のリン酸化基質のためのキナーゼを同定するために、バイオインフォマティクスは、基板と沈殿複合体を形成するキナーゼをリン酸化残基（コンセンサス部位）に隣接する、ならびに特定のアミノ酸の短い保存配列を含むタンパク質を同定するために使用することができます。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、多くの場合、成功して満たしていません。
私たちは、急速に所定の基板13をリン酸化することができるキナーゼを同定するための体系的な機能的なアプローチを開発しました。スクリーンアッセイは、優れた特定の生成します潜在的な同族のキナーゼのために非常に明確な選択と性、。生物学的シグナル伝達にリン酸化の中心性を考えると、画面は、事実上すべての細胞シグナル伝達経路14-16で発見するのに便利です。画面には、ヒトタンパク質キナーゼのライブラリーと、大規模なキナーゼアッセイを実施することを含みます。キナーゼは、細菌のグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）タンパク質でタグ付けされており、組換え酵素があることを意味する、哺乳類細胞抽出物から精製される – 細菌から調製されたものとは異なり、 – 多くの場合に必要な上流のプロテインキナーゼの存在下で生成されます組換え酵素は、インビトロで活性を有すること。セリン、スレオニン、およびチロシンキナーゼ活性は、下流のキナーゼの活性化のために必要としながら実際には、酵母10内に存在する、酵母ゲノムは、500を超える遺伝子17と哺乳類キノームは、するために、かなり複雑になっていることを示す、122プロテインキナーゼをコードしレギュレーションより高次の生物に固有のプロセスをTE。さらに、（例えば、 その他の小分子、増殖因子、ホルモンなど）、細胞生物学およびヒトの疾患に関連した様々な刺激の効果は、適切なコンテキストに14,15モジュレートキナーゼ活性のために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
アプローチ14,15を記述する元の出版以来、180 GST-キナーゼの元のライブラリは、ヒトタンパク質キノームの420のメンバー、または〜80％ にまで拡大されました。拡大ライブラリを使用すると、説明したようにプロトコルは、ホスホおよびデジタル信号増強を使用することによって短縮することができた、（必要と認めた場合）フィルムを開発するために4〜5日、その後1-4日かかり?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NSERCの助成金によってサポートされていました 386634.私たちは有用な議論のためにScreatonラボのメンバーに感謝したいと思います。
Materials
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 uL) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 uL) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 mL) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2X SDS lysis buffer (100 mL) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
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