Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik
Summary
Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.
Abstract
Bu yeni sinyal transdüksiyon yollar aydınlatmak için kullanılabilir fosforile edilmiş alt tabakalar için özel bir insan protein kinazlar tespit için bir tarama platformu geliştirdik. Yaklaşımımız saflaştınldı GST-etiketli insan protein kinazların bir kütüphane ve ilgi konusu bir rekombinant protein alt-tabakanın kullanımı ile ilgilidir. Biz, CREB Düzenlenmiş kopyalayıcı ortak aktifleştirici 2 (CRTC2) bir glükoz ayarlı bir site için kinaz MAP / mikrotübül afinite düzenleyici kinaz 2 (MARK2) tanımlamak için bir beta hücre çoğalması için gerekli olan bir proteini, hem de bu teknolojiyi kullanmıştır tirozin Axl ailesi adaptör protein ELMO fosforilasyonu, hücre metastazı düzenleyicileri olarak kinazlar. Biz bu teknolojiyi tanımlamak ve hücrelerin çevresel uyaranlara tepki nasıl kapsamlı bir haritasını oluşturmak için nasıl yardımcı olabileceğini tartışmak.
Introduction
Protein post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) hücre içi iletişim için gereklidir. Belki de en iyi incelenen PTMS hücre altı konumlanması, konformasyon ve kararlılık, biyokimyasal aktivitesi de dahil olmak üzere protein fonksiyonları, bir sayısız düzenleyen protein kinazlar tarafından katalize fosforilasyon vardır. Hedef proteinler üzerinde fosforilasyon tanımlanması triptik fosfopeptıt haritalaması ile fosforile peptidler 1,2 zenginleştirilmiş örnekler kullanılarak artık standart proteomik tekniklerle gerçekleştirilebilir. Ifade proteomun dörtte üçü 3 fosforile olması beklenen ve 1.000.000 6 kadar tahminleri ile 200,000 fosforilasyon siteleri 5 tespit edilir olsa da, bunların çoğu bir yol ya da protein kinazı sinyal, herhangi bir verilen biyoloji sahiptir.
Fosforile sitelerin tespiti nispeten büyük bir meydan okuma olduğunu, görece kolay olmasına karşınAlt tabaka çiftleri: bu siteleri hedefliyor soydaş kinaz (ler), biz haritalama kinaz olarak adlandırdığımız bir süreci tanımlamak. Alt tabaka çiftleri tarif edilmiştir, ya ilgi kinaz ile başlayan ve yüzeylerde arıyor veya ilgi bir alt tabaka ile başlayan ve bir modifiye kinaz deneysel 7-11 veya hesaplama 12 bulmaya çalışırken: kinaz tanımlamak için çeşitli yaklaşımlar. Bilinen bir fosforile edilmiş substrat için kinazlar tespit etmek için, alt-tabaka biyoinformatik ile çökeltilebilir kompleks oluşturmak kinazlar fosforilatlanmış bir tortu (konsensüs sitesi) yan, hem de tespit amino asitlerin kısa korunmuş dizisini içeren proteinleri tespit etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar, zaman alıcı ve genellikle başarı ile uymayan.
Biz hızla belirli bir alt tabaka 13 fosforile edebilir kinazlar belirlemek için sistematik bir işlevsel yaklaşım geliştirdi. Ekran tahlil mükemmel spesifik üretirPotansiyel soydaş kinazlar için çok net bir seçim ile Sığ. Biyolojik sinyalleşme fosforilasyon merkezi konumu göz önüne alındığında, ekran hemen hemen tüm hücre sinyal yollarının 14-16'da keşfi için yararlıdır. Ekran, insan protein kinazlann bir kütüphane ile geniş çaplı bir kinaz tahlili yerine getirilmesini kapsamaktadır. Kinazlar bakteriyel glutation S-transferaz (GST) proteini ile etiketlenmiş ve rekombinant enzimlerin, yani memeli hücre özütlerinden saflaştırıldı – bakterilerden hazırlanmış olan farklı – genellikle için gerekli yukarı akış protein kinazların varlığında oluşturulur Rekombinant enzimlerin in vitro aktiviteye sahip oldukları. Serin, treonin ve tirosin kinaz aktivitesi alt kinaz aktivasyonu için gereken Nitekim, maya 10 içinde mevcut olan, maya genomu 500 gen üzerinde 17 memeli kinome, için önemli ölçüde daha karmaşık hale gelmiştir belirten 122 protein kinazlan kodlar regulayüksek mertebeden organizmalara özgü süreçleri te. Ayrıca, hücre biyolojisi ve (örneğin, vb küçük moleküller, büyüme faktörleri, hormonlar, gibi), insan hastalığı ile ilgili çeşitli farklı uyarıcı etkisi, uygun bir çerçevede 14,15 modüle kinaz aktivitesi için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yaklaşımı 14,15 tanımlayan özgün yayınlar bu yana, 180 GST-kinazlar orijinal kütüphanesi insan proteini kinome 420 üye, ya da ~% 80 genişletilmiştir. Genişletilmiş kütüphanesi ile, açıklanan protokol (gerekli görüldüğünde gibi) fosforlu ve dijital sinyal iyileştirme kullanılarak kısaltılmış olabilir, hangi filmleri geliştirmek için 4-5 gün sonra 1-4 gün sürer. Dikkat edilmesi gereken birkaç önemli adımlar (protokol bakış için Bkz: Şekil 1) vardır. İl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NSERC hibe tarafından desteklenmiştir 386634. Biz yararlı tartışmalar için Screaton Lab üyelerine teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 uL) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 uL) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 mL) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2X SDS lysis buffer (100 mL) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation–a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. . Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature’s Inventory. , (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
