Levedygtighed Bioprinted Cellular Konstruktioner Ved hjælp af en tre Dispenser kartesiske Printer
Summary
A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.
Abstract
Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.
Introduction
Tissue engineering bruger principperne for biologi og teknik i udviklingen af funktionelle erstatninger at bevare, genoprette eller forbedre indfødte væv og. Evnen til at generere tredimensionelle biomimetiske konstruktioner på efterspørgslen vil lette den videnskabelige og teknologiske fremskridt inden for tissue engineering samt i cellebaserede sensorer, narkotika / toksicitet screening, væv eller tumor-modeller og andre. Den tredimensionale organisering af væv-manipuleret konstruktioner er et grundlæggende element i fabrikation metode, fordi det skal nøje efterligner den meget organiseret samspil mellem celler og ekstracellulære matrix i native væv.
Biologisk nedbrydelige og form-dannende tredimensionale skeletter er kritiske faktorer ved at skabe nye vævskonstruktioner fordi cellerne migrerer til dannelse af et todimensionalt lag af celler, men mangler evnen til at vokse i begunstigede tredimensionalt. Stilladset fungerer som en midlertidig fundament for cellentilknytning og spredning, så det skal være fremstillet af materialer med kontrollerbar porøsitet og bionedbrydelighed, og tilstrækkelig mekanisk integrit. Stilladset materialer bør ikke være cytotoksiske eller oprette en uheldig reaktion fra værten. Hydrogeler har været almindeligt anvendt i væv teknikker, og på grund af deres hydrofilicitet, hydrogeler tillade væske og gasudveksling hele struktu. Ved at kombinere forskellige hydrogeler, den syntetiserede hydrogelens egenskaber er modificerbare at opfylde særskilt program krav.
Den konventionelle vævsmanipulering tilgang indebærer skabelsen af acellulære porøse offer stilladser, der er podet med celler efter fabricatio. Mange teknikker er blevet anvendt, såsom fiber-binding, støbning opløsningsmiddel og smeltestøbning, men viste sig at være minimalt succes for vævsdyrkningsapplikationer. Fiberbinding metoder tillader fibre skal tilpasses i bestemte former, men de er kun i stand til produktion meget tynde stilladset. Opløsningsmiddel støbemetoder produceret meget porøse konstruktioner, men den største producerede membran var kun 3 mm thic. Derfor skaber tredimensionale konstruktioner ikke er mulig ved hjælp af disse teknikker. Melt støbeteknikker vist sig effektive til at producere tredimensionelle stilladser, men der kræves så høje temperaturer, at biologiske materialer ikke kan indarbejdes i løbet af produktions- proces. Stilladser seedet post-fabrikation er begrænsede i deres evne til at opfylde kravene i tissue engineering til at producere tredimensionelle stilladser med foruddefinerede eller kontrollerbare mikrostrukturer og. Et andet stort problem med solide stillads seeding teknologier er mangel på vaskularisering og dårlig mekanisk.
Bioprinting er siden blevet udvidet til tre dimensioner ved hjælp af ikke-toksiske, bionedbrydelige, termoreversible geler til at overvinde ulemperne ved konventionelle. Et par af de faste freeform fabrikation techniques øjeblikket anvendes, er laser-assisteret bioprinting og inkjet print. Laser-assisteret bioprinting teknikker bruger en pulserende laser kilde, en måltavle, og en modtagende substrat til at generere tre-dimensionelle. Imidlertid er denne teknik begrænset på grund af lav kapacitet, levedygtighed lav celle, og kan kun fremstille begrænsede arrangementer af fabrikerede strukturer, fordi kun fotokrydsbindbare præpolymerer kan anvendes til dannelse af en tværbundet hydrogel. Inkjet print blev udviklet som en berøringsfri metode, der gengiver digitale billeddata på et substrat ved at deponere picoliter blæk. Men inkjet print ikke producere en høj opløsning konstruktion, konstruerer erfaring hurtige proteindenaturering, og mange af cellerne lyseres under afsætningen.
I øjeblikket er der udviklet nye additiv fremstilling bioprinting metoder. I disse systemer celler, proteiner, vækstfaktorer og biomimetiske hydrogeler typisk integreret i matrix materIALS under produktionsprocessen og samtidig afsættes ved hjælp af edb-styrede aktuatorer til at generere tredimensionelle stillads-baserede celle-laden konstruktioner, der nøje efterligner mikroarkitektur af indfødte. Celle-lastet hydrogeler udgør bioink, som kan være heterogen, der består af flere celletyper, eller homogen. Tilsætningsstof fremstillingssystemer deponering bioink drop-by-drop eller lag-på-lag via engangssprøjter og tips på en computerstyret fase stand til at bevæge sig i X, Y og Z-retning. Gennem computersoftware, kan arkitektur trykte stilladser nemt manipuleres afhængigt krav til ansøgningen. I modsætning til konventionelle teknikker, kan tre-dimensionelle medicinske teknologier (magnetisk resonans imaging, computer tomografi) indarbejdes i design, genererer patient-specifikke konstruktion. Disse fremgangsmåder tillader også muligheden for at producere vaskulariserede udskiftninger, fordi konstruktioner produceres med en højere local celletæthed, så celle-celle-interaktioner og forbedre sandsynligheden for post-implantation surviva.
Palmetto printer er en specialbygget tredimensionale multi-dispenser system, der bruger programmerbare robot fremstillingsmetoder at generere tredimensionale heterogene vævskonstruktioner (figur 1). Det tillader brugen af en flerhed af materialer i unikke kombinationer til frembringelse af heterogene strukturer. Initialisering af bioprinter er et af de vigtigste skridt i bioprinting fordi det giver dig mulighed for at indstille en række parametre for at optimere trykbarheden af de bioprinted konstruktioner.
Den bioprinter omfatter en batch typen proces med start, drift og nedlukning sekvenser styres af en programmerbar logisk styreenhed (PLC), som brugeren opererer gennem en interaktiv touch screen kontrolpanel (figur 1, A). For at undgå kontaminering af biologiske materialer af bioprinter er indesluttet i et positivt presset poly (methylmethacrylat) (PMMA) kammer med en højeffektiv partikelformet arrestance (HEPA) -filtered luftcirkulation (figur 1, B, C). Det indre af printeren kan steriliseres ved hjælp af de indbyggede ultraviolet lyskilder (figur 1, D). Den centrale del af bioprinter er en fuldt programmerbar positionering robot, der reproducerbart kan placere en dispenser spids med en nøjagtighed på 10 mikrometer (figur 1, E). Der er tre dispensere, som er i stand til at deponere mængder så små som 230 nl anvendelse af en roterende skrue (figur 1, F). De er uafhængigt programmeres ved hjælp af separate computere, der styrer trykning parametre for hver dispenser (figur 1, G). Roterende skrue dispensering udnytter rotationen af en motordrevet skrue til at bevæge sig ned bioink en sprøjte og ud af sprøjten. Disse dispensere er monteret på en pneumatiskly kontrolleret Tool Nest (figur 2A, B), således at robotten at skifte dispenser monteret på Z-aksen robotarm under programmeret styring (figur 1, H).
XYZ robot modtager udskrivningsinstruktioner fra en computer, der kører design software (figur 1, I). Hvert program indeholder dispensering steder, kalibrering rutiner og dispenser skiftende protokoller. Udformningen af genererede konstruktioner består primært af XYZ koordinater hvor hver dispenser vil deponere materialet. Den bioprinter omfatter to optiske lyssensorer (figur 2C), der bestemmer XYZ koordinater af sprøjten spids ende. Disse sensorer sender koordinering af informationer til robotten, der bruger dem til at beregne positionerne for flaskespidsen ender. Der er en ekstra forskydning laser (figur 2D), at projekter en 633 nm diode rød laserstråle af spot størrelse 30 x 100 mikrometer til at måle afstand med en ACCURAcy på 0,1 mikrometer. Når strålen er meget fokuseret robotten bestemmer Z afstand af trykfladen. Denne måling, og den optiske lyssensorer måling af den spidse ende i Z, muliggør beregning af præcise Z-koordinater anvendes til at placere flaskespidsen i forhold til udskrivningen overflade. De dispenserspidser bevæge sig lateralt og vertikalt gennem X-aksen orienteret optisk lysføler at finde de Y- og Z-centre, og sideværts gennem et Y-aksen sensor til at finde midten af X-aksen. Trykfladen er kortlagt ved hjælp af formlen for et fladt plan i xyz plads: ax + by + cz = d for at bestemme, hvor overfladen er i forhold til positionen af dispenser spidsende. Printeren trin (figur 1, J) har en prøve petriskål op til 80 mm i diameter og bruger en recirkulerende vandbad for at opretholde den indstillede temperatur (figur 1, K). Stage Temperaturen kan indstilles inden for et område på -20 og forbliver stabil indenfor. Der er en USB-kamera monteretpå robotten Z-arm for at tilvejebringe en forstørret visning af udleveringsspidsen under trykprocessen (figur 1, L). Der er et andet kamera monteret mod toppen af kammeret interiør, der giver et komplet billede af bioprinter under trykprocessen (figur 1, L).
En computer-aided design tegneprogrammet bestemmer deposition mønster og tillader brugeren at generere trinvist fordelte dråber og komplekse strukturer (figur 3). Tredimensionale veje kan manuelt kodet ind i printeren-kompatible design software eller importeret fra et separat computerstøttet design tegning software (figur 4, tabel 1). Printeren-kompatibel software giver variationer af udskrivning parametre som deposition metoden (enkelt dråbe aflejring eller kontinuerlig sti deposition), tre-dimensionelle geometri veje, deposition sats, afstanden mellem sprøjtens spids ende og substsats trykflade, mængden af tid til at deponere en individuel dråbe, og højden og fremskynde sprøjten løftes mellem aflejring af dråberne. Hvert program indeholder XYZ dispensersystemer steder, tip kalibrering rutiner og dispenser skiftende protokoller til at give et sterilt miljø, uden at operatøren griber ind, under udskrivning. Den programmerbare logiske styreenhed (PLC) af robotten modtager instruktioner fra computeren kører design software og styrer timingen af begivenhederne fra de eksterne controllere (f.eks dispenserne). For at gøre dette, bruger PLC'en en looping mekanisme til at styre dispensere , robot positionering enhed, og miljømæssige faktorer.
Tredimensionale direkte-write bioprinting anvendelse af en roterende skrue, flydende dispenseringssystem tillader processen med at indsætte celler at være mere effektiv, præcis og nemmere end tidligere metoder. Denne undersøgelse viser specialbygget bioprinter er i stand til at generere cell-laden hydrogel konstruktioner med levedygtighed høj celle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det primære fokus for tissue engineering er at bygge bro mellem mangel orgel og transplantationscentre behov ved at udvikle biologiske erstatninger i stand til at genoprette, vedligeholde eller forbedre indfødte væv functio. Dette har ført til den direkte fremstilling af stilladser med en kompleks, anatomisk korrekte eksterne geometri og præcis kontrol over den interne geometr. Tredimensionale bioprinting er en metode, der anvendes til at frembringe tredimensionale konstruktioner i forskellige størrelser og former…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af regeringen Støtte under Grant nr EPS-0903795 udstedt af National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), og Grant 8P20 GM103444 (YM PI).
Materials
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37°C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37°C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80°C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80°C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37°C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37°C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20°C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20°C until use |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. . Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Derby, B. Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Kachurin, A. M., et al. Direct-Write Construction of Tissue-Engineered Scaffolds. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 698, 10-1557 (2002).
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds. European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).
- Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F. Rapid Prototyping in Tissue Engineering. Challenges and Potential. Trends Biotechnol. 22 (12), 643-652 (2004).
- Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques. Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).
- Burg, K. J. L., Boland, T. Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing. IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Khalil, S., Nam, J., Sun, W. Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D. Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).
- Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries. Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).
- Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration. Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).
- Gruene, M., et al. Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions. Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).
- Khalil, S., Sun, W. Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs. J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).
- Xu, T., et al. Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).
- Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models. Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).
- Chung, J. H. Y., et al. Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering. Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).
- Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).
- Lu, L., Mikos, A. G. The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering. MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).
- Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
- Devillard, R., et al. Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting. Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).
- Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer. Gene Ther Reg. 6 (1), 33 (2011).
- Xu, T., et al. Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method. Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).
- Calvert, P. Inkjet Printing for Materials and Devices. Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).
- Li, M. G., Tian, X. Y. A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction. Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).
- Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).
- Rowley, J. A., Madlambaya, G. Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool. Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).
- Ozbolat, I., Yu, Y. Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes. Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).
- Jia, J., et al. Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).
- Forty, R. A., Steinberg, M. S. The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
- Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery. Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).
- El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges. Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).
- Smith, C. M., et al. Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs. Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).
- Ozbolat, I. T., Chen, H. Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs. Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X. Adv Mater. X, x-y (2014).
