三ディスペンサーデカルトプリンタを使用してBioprinted細胞構築物の生存率
Summary
A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.
Abstract
Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.
Introduction
組織工学は、維持、復元、または天然組織を強化し、機能するために代替の開発に生物学と工学の原則を使用しています。オンデマンドで三次元バイオミメティック構造体を生成する機能は、組織工学におけるならびに細胞ベースのセンサ、薬物/毒性スクリーニング、組織または腫瘍モデル、およびその他における科学技術の進歩を促進するであろう。それは密接に細胞と天然組織における細胞外マトリックスの高度に組織化された相互作用を模倣する必要があるため、組織工学構造物の三次元組織は、製造方法の基本的なコンポーネントです。
生分解性と形状形成三次元足場は、細胞が、細胞の二次元の層を形成するために移行するので、新規な組織構築物を生成する際に重要な要素であるが、好ま三次元で増殖する能力を欠いています。足場は、細胞の一時的な基盤として機能します添付ファイルおよび増殖するので、制御可能な多孔性および生分解性、および十分な機械的INTEGRITを有する材料から構成されなければなりません。足場材料は、細胞毒性であるか、またはホストからの有害反応を作成することはできません。ヒドロゲルは、一般に、組織工学技術において使用されており、それらの親水性のために、ヒドロゲルはstructurを通して流体及びガス交換を可能にします。異なるヒドロゲルを組み合わせることにより、合成されたハイドロゲルの特性は、異なるアプリケーションの要件を満たすために修正可能です。
従来の組織工学的手法は、細胞ポストfabricatioを播種する無細胞多孔質の犠牲足場の作成が含まれます。多くの技術は、ファイバ結合、溶媒キャスティングのように、使用され、溶融成形が、組織工学用途のための最低限の成功であることが証明されています。繊維結合方法は、繊維を特定の形状に整列されることを可能にするが、それらは、プロだけが可能です非常に薄い足場をducing。高度に多孔質構造体を製造し、ソルベントキャスト法では、しかし、最大の製造された膜はわずか3 mmのTHICました。このため、三次元構造を作成することは、これらの技術を用いて実現可能ではありません。溶融成形技術は、三次元足場を製造するのに成功したが、このような高温は、生物学的材料は、製造プロセスへ中に組み込むことができないことが要求されます。足場は、製造後の予め定義された又は制御可能な微細構造を有する三次元の足場を製造するために、組織工学の要件を満たす能力に制限されて播種し。固体足場播種技術のもう一つの大きな問題は、血管新生及び不十分な機械的の欠乏です。
Bioprinting以来、従来の欠点を克服するために、非毒性、生分解性、熱可逆性ゲルを使用して3次元に拡張されました。固体自由形状製造トン数現在採用されてechniquesは、レーザ支援bioprintingおよびインクジェット印刷されています。レーザ支援bioprinting技術は、三次元の生成するパルスレーザ源、ターゲットプレート、および受け基板を使用します。しかし、この技術は低いスループット、低い細胞生存率に制限され、唯一の光架橋性プレポリマーは架橋ヒドロゲルを形成するために使用することができるので、製造される構造だけの限られた配置を生成することができます。インクジェット印刷は、ピコリットルのインクを堆積させることによって、基板上にデジタル画像データを再生する非接触方法として開発されました。しかしながら、インクジェット印刷は、高解像度の構築物を生成しない、経験急速なタンパク質の変性を構築し、そして細胞の多くは、堆積中に溶解されます。
現在、新たな添加剤の製造bioprinting方法が開発されています。これらのシステムでは、細胞、タンパク質、成長因子、および生体模倣ヒドロゲルは、典型的には、マトリックスに組み込まれている母校IALS製造プロセス中に、同時に密接にネイティブのマイクロアーキテクチャを模倣する三次元骨格系の細胞を含んだ構築物を生成するために、コンピュータ制御のアクチュエータを使用して堆積されます。細胞を含んだヒドロゲルは、複数の細胞型、または均質からなる、不均質であることができるbioinkを構成します。添加剤の製造システム堆積bioink滴ずつx、y及びz方向に移動することができるコンピュータ制御ステージ上または層ごとの使い捨て注射器および先端経由。コンピュータソフトウェアを介して、印刷された足場のアーキテクチャは、容易にアプリケーションの要件に応じて操作することができます。従来の技術とは異なり、3次元医用技術（磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影法）は、患者特異的構築物を生成し、設計に組み込むことができます。構築物は、より高いLで製造されるため、これらの方法は、血管新生の置換を生成する可能性を可能にしますOCAL細胞密度、細胞 – 細胞相互作用を可能にし、移植後のsurvivaの可能性を向上させることができます。
パルメットプリンタは、三次元の異種の組織構築物（ 図1）を生成するためにプログラム可能なロボットの製造方法を使用して特注の三次元マルチディスペンサーシステムです。それは、ユニークな組み合わせで、複数の材料の使用は、不均質構造を生成することができます。 bioprinterの初期化は、それはあなたがbioprintedコンストラクトの印刷適性を最適化するために、様々なパラメータを設定することができますのでbioprintingの中で最も重要なステップの1つです。
bioprinterは、ユーザが対話式タッチスクリーン制御パネルを介して動作するプログラマブルロジックコントローラ（PLC）、（ 図1、A）で制御起動動作および停止配列とバッチ式プロセスを含みます。バイオの汚染を防止するために、論理材料bioprinterが正に加圧されたポリ（メチルメタクリレート）で囲まれた高効率粒子arrestance（HEPA）を有する（PMMA）チャンバは、空気循環システムを-filtered（ 図1、B、C）。プリンタの内部には、内蔵の紫外線光源（ 図1、D）を用いて滅菌することができます。 bioprinterの中心的なコンポーネントは、再現性10マイクロメートル（ 図1、E）の精度でディスペンサーチップを置くことができ、完全にプログラム可能な位置決めロボットです。ロータリースクリューを使用して230 NL（ 図1、F）のように、少量を堆積することができます3ディスペンサーがあります。彼らはそれぞれのディスペンサーのための印刷パラメータ（ 図1、G）を支配する別のコンピュータを使用して、独立してプログラム可能です。ロータリースクリュー分配は、注射器の下、シリンジ先端の外bioink移動するモータ駆動スクリューの回転を利用しています。これらのディスペンサーはpneumaticalに搭載されていますロボットは、ディスペンサーを切り替えることが可能LY制御ツールネスト（ 図2A、B）は 、プログラム制御下でZ軸ロボットアーム（ 図1、H）上に取り付けられています。
XYZロボットは設計ソフトウェア（ 図1、I）を実行しているコンピュータからの印刷指示を受けます。各プログラムは、分配場所、キャリブレーション・ルーチン、およびディスペンサー変化のプロトコルが含まれています。生成された構造物の設計は、主に、XYZから成り、各ディスペンサが材料を堆積する場所を調整します。 bioprinterシリンジ先端のXYZ座標を決定する2つの光の光センサ（ 図2C）を含みます 。これらのセンサは、ディスペンサー先端の位置を計算するためにこれらを使用してロボットに座標情報を送信します。 ACCURAで距離を測定するために30×100マイクロメートルのスポットサイズの633nmのダイオード赤色レーザ光 を投射する追加の変位をレーザー（ 図2D）があります0.1マイクロメートルのCY。ビームが高度に集中した場合、ロボットは、印刷面のZ距離を決定します。この測定値、およびZにおける先端部の光学的光センサ測定値は、印刷面に関連してディスペンサー先端部を配置するために使用される正確なZ座標を計算することができます。分注チップは、X軸の中心を見つけるために、横方向にY軸センサを介してYとZの中心を見つけるために、X軸配向光学的光センサを介して横方向および垂直方向に移動し、。表面は、分配先端部の位置を基準にして場所を決定するために+ CZ = dで斧+：印刷面は、XYZ空間における平面の数式を使用してマッピングされています。プリンタステージ（ 図1、J）は 、直径80 mmのサンプルペトリ皿を保持し、設定温度（ 図1、K）を維持するために再循環水浴を使用しています。ステージ温度は、-20の範囲内に設定し、内部で安定したままことができます。 USBカメラを装着ありロボットZアームに印刷工程（ 図1、L）の間に分配チップの拡大図を提供します。印刷工程（ 図1、L）の間にbioprinterの完全なビューを提供し、チャンバ内部の上面に向けて取り付けられた第2のカメラがあります。
ソフトウェアを描画するコンピュータ支援設計は、堆積パターンを決定し、増分的に離間した液滴や複雑な構造（ 図3）を生成することを可能にします。三次元の経路を手動でプリンタと互換性のある設計ソフトウェアにコード化または別のコンピュータ支援設計図面ソフトウェア（ 図4、表1）からインポートすることができます。プリンタ対応のソフトウェアは、印刷、このような蒸着法（単一打滴または連続経路蒸着）などのパラメータ、経路の三次元形状、堆積速度、シリンジ先端との間の距離とSUBSTのバリエーションを可能にしますレート印刷面、個々のドロップ、および高さを堆積し、注射器を高速化するための時間の量は、液滴の堆積の間に持ち上げられます。各プログラムは、印刷時に、オペレータの介入なしに、無菌環境を提供するために、XYZ調剤場所、先端校正ルーチン、ディスペンサー変化のプロトコルが含まれています。ロボットのプログラマブル・ロジック・コントローラ（PLC）は、設計ソフトウェアを実行するコンピュータからの指示を受けて、外部コントローラ（例えば、ディスペンサー）からのイベントのタイミングを制御する。これを行うには、PLCは、ディスペンサーを制御するためにループ・メカニズムを使用して、ロボット位置決め装置、および環境要因。
三次元直接書き込みロータリースクリュー、液体分配システムを利用しbioprintingが堆積細胞の処理は、従来の方法よりも、効率的で正確、かつ容易にすることができます。本研究では、カスタム構築されたbioprinterは、CEを生成することが可能であることを示していますLLを含んだヒドロゲルは、高い細胞生存率を構築します。
Protocol
Representative Results
Discussion
組織工学の主な焦点は、復元維持、または天然組織のfunctioを向上させることが可能な生物学的な代替を開発することによって、臓器不足や移植の必要性との間のギャップを埋めることです。これは、複合体と足場の直接製造、解剖学的に正しい外部ジオメトリ、および内部geometrを正確に制御するに至りました。三次元bioprintingはレイヤー・バイ・レイヤーapproacを用いてデジタルモデルから?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、助成金番号EPS-0903795国立科学財団、NIH NIDCR R01-DE019355（MJY PI）、及びグラント8P20 GM103444（YM PI）によって授与の下で政府の支援によってサポートされていました。
Materials
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37°C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37°C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80°C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80°C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37°C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37°C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20°C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20°C until use |
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