Жизнеспособность Bioprinted Сотовые конструктов Использование Три диспенсер декартово принтера
Summary
A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.
Abstract
Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.
Introduction
Тканевая инженерия использует принципы биологии и инженерии в развитии функциональных заменителей для поддержания, восстановления или повышения родной ткани и. Возможность генерации трехмерных биомиметических конструкции по требованию будет способствовать научные и технологические достижения в тканевой инженерии, а также датчики на основе клеток, препарат / скрининга токсичности, ткани или опухоли моделей, и прочее. Трехмерная организация тканевой инженерии конструкций является основным компонентом метода изготовления, потому что она должна точно имитировать высоко организованной взаимодействие клеток и внеклеточного матрикса в нативной ткани.
Биологически и форма формирования трехмерных леса являются важнейшими факторами в создании новых конструкций ткани, потому что клетки мигрируют, чтобы сформировать двумерный слой клеток, но не имеют возможности расти в благоприятствования трехмерным. Леса служит основой для временного клеткипривязанность и оружия, поэтому он должен быть изготовлен из материалов с контролируемой пористостью и биологическому разложению, и достаточной механической IntegrIT. Эшафоте материалы не должны быть цитотоксическое или зарегистрироваться побочной реакции от хоста. Гидрогели были широко используется в тканевой инженерии методов, и из-за их гидрофильности гидрогели позволяют жидкости и газа обмен на протяжении Структур. Комбинируя различные гидрогели, свойства синтезированных гидрогеля являются изменению встретиться отличный требование приложений.
Обычный тканевой инженерии подход предполагает создание бесклеточных пористых жертвенных лесов, которые засевали клетки после fabricatio. Были использованы многие методы, такие как волокна, литье соединения растворителя, и формование расплава, но оказалось успешным для минимально тканевой инженерии. Методы волоконной контактной позволяют волокна должны быть выровнены в конкретные формы, но они способны только проducing очень тонкий каркас. Растворитель методы литья производится очень пористые конструкции, однако по величине производства мембраны только 3 мм thic. Таким образом, создания трехмерных конструкций не представляется возможным с помощью этих методов. Формование расплава оказались успешными в производстве трехмерных каркасов, но такие высокие температуры, что необходимо биологические материалы не могут быть включены в процессе производства предпосе. Строительные леса высевают пост-изготовление ограничены в своей способности удовлетворять требованиям тканевой инженерии для получения трехмерных каркасов с заранее определенными или контролируемых микроструктур и. Еще одним важным вопросом с твердыми технологий эшафот посев дефицит васкуляризации и плохой механической.
Bioprinting была расширена, чтобы трех измерениях путем использования нетоксичных биологически, термообратимый гелей для преодоления недостатков обычных. Некоторые из твердой свободной формы изготовления тechniques настоящее время используемые в лазерной помощь bioprinting и струйной печати. Лазерные методы помощь bioprinting использовать импульсный лазерный источник, а мишень, и приемное субстрат для создания трехмерной. Однако этот метод ограничен из-за низкой пропускной способности, низкой жизнеспособности клеток, и может производить только ограниченные меры по созданных структур, так как только photocrosslinkable форполимеры могут быть использованы для образования сшитого гидрогеля. Струйная печать была разработана в качестве методологии бесконтактного который воспроизводит цифровые данные изображения на подложке путем нанесения пиколитр чернила. Тем не менее, струйная печать не производит с высокой разрешающей способностью конструкции, создает опыт быстрого денатурации белка, и многие из клетки лизируют при осаждении.
В настоящее время новые методы производства добавки bioprinting были разработаны. В этих системах клеток, белки, факторы роста и биомиметические гидрогели, как правило, интегрированы в матрицу оболочкиМОГВ в процессе изготовления и одновременно на хранение использовании приводов с компьютерным управлением для создания трехмерных эшафот основе клеточных нагруженные конструкции, которые тесно имитирующие микроархитектуру родной. Гидрогели клеток нагруженные составляют bioink, который может быть гетерогенным, состоящая из нескольких типов клеток, или однородным. Добавка производственные системы хранения bioink капельный или слой за слоем через одноразовые шприцы и советы на стадии компьютерным управлением, способный двигаться в направлениях X, Y, и Z. Через программное обеспечение, архитектура печатных лесов можно легко манипулировать в зависимости от требований приложения. В отличие от обычных методов, трехмерные медицинские технологии (магнитно-резонансной томографии, компьютерной томографии) могут быть включены в конструкции, создавая конкретного пациента конструкцию. Эти методы позволяют также возможность получения васкуляризированных замены, потому что конструкции изготавливаются с высокой лOCAL плотность клеток, что позволяет межклеточных взаимодействий и повышения вероятности после имплантации SURVIVA.
Принтер Palmetto обычай построен трехмерная система мульти-распределитель, который использует программируемые роботов производственные методы для генерации трехмерных конструкций разнородных тканей (рисунок 1). Это позволяет использовать множество материалов в уникальных комбинаций для получения гетерогенных структур. Инициализация bioprinter является одним из самых важных шагов в bioprinting, потому что это позволяет вам установить различные параметры для оптимизации печатные из bioprinted конструкций.
Bioprinter включает процесс периодического типа с запуска, эксплуатации и остановки последовательностей, управляемых программируемым логическим контроллером (PLC), который пользователь работает через интерактивной панели управления с сенсорным экраном (рис 1, а). Для предотвращения загрязнения биологические материалы bioprinter заключена в положительно давление поли (метилметакрилата) (ПММА) камера с частицами задерживаемость высокоэффективной (НЕРА) -filtered систему циркуляции воздуха (фиг.1, В, С). Интерьер принтера можно стерилизовать с помощью встроенных в источники ультрафиолетового излучения (рис 1, D). Центральный компонент bioprinter является полностью программируемым позиционирования робота, который может воспроизводимо разместить наконечник дозатора с точностью до 10 мкм (рис 1, е). Есть три диспенсеры, которые способны внести, объем до 230 NL с использованием винтовых (рис 1, F). Они программируются независимо с помощью отдельных компьютеров, которые управляют параметры печати для каждого дозатора (рисунок 1, G). Роторно-винтовые дозирования использует вращение винта с приводом от двигателя, чтобы переместить вниз bioink шприца и из наконечника шприца. Эти дозаторы смонтированы на пневматическиеLY контролируется Гнездо инструмент (2А, Б), что позволяет роботу переключаться дозатор, установленный на оси Z. манипулятора под программным управлением (рис 1, H).
Ской робот получает инструкции по печати с компьютера под управлением разработки программного обеспечения (Рисунок 1, я). Каждая программа содержит дозирующих местоположения калибровки процедуры, и дозатор с изменением протоколов. Конструкция генерируемых конструкций, прежде всего, состоит из XYZ координат, где каждый распылитель будет вносить материал. Bioprinter включает два оптических датчиков света (рис 2С), которые определяют XYZ координаты конца наконечника шприца. Эти датчики отправить информацию о координатах для робота, который использует их для расчета позиции концах распределитель наконечник. Существует дополнительный лазер смещение (рис 2D), что проецирует 633 нм диодный красный лазерный луч размера пятна 30 х 100 мкм для измерения расстояния с AccuraCY 0,1 микрометров. Когда луч очень сосредоточена робот определяет Z расстояние поверхности печати. Это измерение, и оптический датчики света измерение верхнего конца в Z, позволяет рассчитывать точную Z координат используется для размещения кончика дозатора по отношению к поверхности печати. Советы диспенсер двигаться в сторону и вертикально через ось Х ориентированных оптического датчика света, чтобы найти Y и Z центры, и в поперечном направлении с помощью датчика по оси Y. найти центр X-оси. Поверхность печати отображается с использованием формулы для плоской поверхности в пространстве хуг: Ax + от + сг = D чтобы определить, где поверхность по отношению к положению верхнего конца дозирования. Этап принтер (Рисунок 1, J) имеет образец чашки Петри до 80 мм в диаметре и использует рециркуляции воды ванны для поддержания заданной температуры (рисунок 1, K). Температура Стадия может быть установлен в диапазоне от -20 и остается стабильным в течение. Существует камера USB установленна робота-руку Z, чтобы обеспечить увеличенный вид наконечника раздаточного в процессе печати (фиг.1, L). Существует второй камерой, установленной в направлении верхней части внутренней камеры, что обеспечивает полное представление о bioprinter в процессе печати (фиг.1, L).
Компьютерный дизайн рисунок программное обеспечение определяет характер осаждения и позволяет пользователю создавать постепенно расположенных капель и сложные структуры (рисунок 3). Трехмерные пути могут быть вручную запрограммированы в принтере-совместимый дизайн программного обеспечения или импортировать из отдельного компьютера автоматизированного проектирования программного обеспечения рисования (рисунок 4, таблица 1). Программное обеспечение принтера, совместимый позволяет вариации параметров печати, таких как метод осаждения (один осаждения капель или непрерывного осаждения путь), трехмерной геометрии путей, скорости осаждения, расстояния между концом наконечника шприца и ПодстСкорость печати поверхность, то количество времени для осаждения отдельной капли, и высоты и скорости шприц поднимается между осаждением капель. Каждая программа содержит XYZ дозирующих местоположения калибровки наконечник процедуры, и дозатор с изменением протоколов, чтобы обеспечить стерильную среду, без вмешательства оператора, во время печати. Программируемый логический контроллер (ПЛК) робота получает инструкции от компьютера под управлением проектирования программного обеспечения и контролирует сроки событий от внешних контроллеров (например, диспенсеры). Чтобы сделать это, ПЛК использует циклическую механизм контроля дозаторы роботизированная устройство позиционирования, и экологические факторы.
Трехмерная bioprinting прямой записи с использованием роторно-винтовой, жидкости системы дозирования позволяет процесс осаждения клеток, чтобы быть более эффективным, точным и легче, чем предыдущие методы. Это исследование показывает, обычай построен bioprinter способен генерировать сеLL-Ладена гидрогелевые конструкции с высокой жизнеспособности клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основное внимание в тканевой инженерии является преодоление разрыва между нехваткой органов и потребностей трансплантации, развивая биологические заменители, способные восстановления, поддержания или улучшения родной ткани ФУНКЦИИ. Это привело к прямому изготовления каркасов с ко?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана государственной поддержки при грант № САЭ-0903795 награжденных Национального научного фонда, NIH NIDCR R01-DE019355 (мЯн PI), и Грант 8P20 GM103444 (Ю.М. PI).
Materials
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37°C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37°C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80°C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80°C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37°C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37°C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20°C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20°C until use |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. . Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Derby, B. Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Kachurin, A. M., et al. Direct-Write Construction of Tissue-Engineered Scaffolds. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 698, 10-1557 (2002).
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds. European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).
- Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F. Rapid Prototyping in Tissue Engineering. Challenges and Potential. Trends Biotechnol. 22 (12), 643-652 (2004).
- Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques. Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).
- Burg, K. J. L., Boland, T. Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing. IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Khalil, S., Nam, J., Sun, W. Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D. Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).
- Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries. Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).
- Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration. Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).
- Gruene, M., et al. Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions. Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).
- Khalil, S., Sun, W. Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs. J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).
- Xu, T., et al. Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).
- Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models. Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).
- Chung, J. H. Y., et al. Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering. Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).
- Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).
- Lu, L., Mikos, A. G. The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering. MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).
- Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
- Devillard, R., et al. Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting. Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).
- Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer. Gene Ther Reg. 6 (1), 33 (2011).
- Xu, T., et al. Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method. Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).
- Calvert, P. Inkjet Printing for Materials and Devices. Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).
- Li, M. G., Tian, X. Y. A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction. Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).
- Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).
- Rowley, J. A., Madlambaya, G. Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool. Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).
- Ozbolat, I., Yu, Y. Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes. Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).
- Jia, J., et al. Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).
- Forty, R. A., Steinberg, M. S. The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
- Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery. Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).
- El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges. Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).
- Smith, C. M., et al. Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs. Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).
- Ozbolat, I. T., Chen, H. Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs. Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X. Adv Mater. X, x-y (2014).
