Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker
Summary
A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.
Abstract
Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.
Introduction
Tissue Engineering nutzt die Prinzipien der Biologie und Technik in der Entwicklung von Funktionsersatz zu erhalten, wiederherzustellen oder zu verbessern nativem Gewebe und. Die Fähigkeit zur Erzeugung von dreidimensionalen biomimetischen Konstrukte auf Anforderung würde wissenschaftliche und technologische Fortschritte in der Gewebetechnik sowie in zellbasierten Sensoren Arzneimittel / Toxizitäts, Gewebe- oder Tumormodellen, und andere zu erleichtern. Die dreidimensionale Organisation des Tissue-Engineering Konstrukten ist ein wesentlicher Bestandteil des Herstellungsverfahrens, da es eng die hoch organisierten Wechselwirkung von Zellen und extrazellulärer Matrix in nativem Gewebe nachahmen.
Biologisch abbaubar und formgebenden dreidimensionalen Gerüsten sind entscheidende Faktoren bei der Erzeugung von neuen Gewebekonstrukte, da die Zellen wandern, um eine zweidimensionale Schicht von Zellen zu bilden, aber die Fähigkeit fehlt, in bevorzugten dreidimensionalen wachsen. Das Gerüst dient als Grundlage für die vorübergehende Zellund die Zellenproliferation, also muss es aus Materialien mit steuerbarer Porosität und biologische Abbaubarkeit und eine ausreichende mechanische integrit konstruiert werden. Die Trägermaterialien sollten nicht zytotoxisch sein, oder erstellen Sie einen negativen Antwort vom Host. Hydrogele wurden häufig in Tissue Engineering-Techniken verwendet werden, und aufgrund ihrer Hydrophilie ermöglichen Hydrogele Flüssigkeits- und Gasaustausch im ganzen Structur. Durch die Kombination verschiedener Hydrogele, sind die Eigenschaften des synthetisierten Hydrogels modifizierbaren um verschiedene Anwendungsanforderungen zu erfüllen.
Die herkömmliche Tissue-Engineering-Ansatz beinhaltet die Schaffung von azellulären poröse Opfergerüste, die mit Zellen post-fabricatio ausgesät werden. Viele Techniken verwendet worden, wie beispielsweise Faserbindung, Lösungsmittelgießen und Schmelzformen, doch erwies sich minimal erfolgreich für das Tissue Engineering-Anwendungen zu sein. Faserbindungsverfahren ermöglichen Fasern in bestimmten Formen ausgerichtet werden, aber sie sind nur in der Lage, pro sindGabe sehr dünnen Gerüst. Lösungsmittel-Gießverfahren hergestellte hochporöse Konstrukte jedoch die größte hergestellte Membran war nur 3 mm thic. Daher schaffen dreidimensionale Konstrukte nicht möglich ist die Verwendung dieser Techniken. Schmelzformungstechniken bewährt bei der Herstellung von dreidimensionalen Gerüsten, aber solch hohe Temperaturen erforderlich, dass biologische Materialien nicht in den Fertigungsprozess integriert werden. Gerüste ausgesät nach der Herstellung sind in ihrer Fähigkeit, die Anforderungen des Tissue Engineering zu treffen, um dreidimensionalen Gerüsten mit vordefinierten oder steuerbare Mikrostrukturen und produzieren begrenzt. Ein weiteres wichtiges Thema mit soliden Gerüst Aussaat Technologien ist der Mangel an Durchblutung und schlechte mechanische.
Bioprinting seitdem auf drei Dimensionen durch die Verwendung von nicht-toxischen, biologisch abbaubaren, thermoreversible Gele, die Nachteile des herkömmlichen überwunden erweitert. Ein paar von den festen Freiform-Herstellungs techniques derzeit verwendet werden, sind die lasergestützte Bioprinting und Inkjet-Druck. Lasergestütztes Bioprinting Techniken verwenden eine gepulste Laserquelle, einer Zielplatte, und einem Empfangssubstrat zu erzeugen dreidimensional. Jedoch ist diese Technik aufgrund der geringen Durchsatz, geringe Lebensfähigkeit der Zellen beschränkt und kann nur begrenzte erzeugen Anordnungen gefertigten Strukturen, da nur photovernetzbaren Prepolymere verwendet werden können, um ein vernetztes Hydrogel zu bilden. Tintenstrahldruck wurde als berührungslose Methode, die digitalen Bilddaten auf einem Substrat durch Abscheidung wieder Picoliter Tinte entwickelt. Jedoch Tintenstrahldruck nicht ein hochauflösendes Konstrukt zu erzeugen, konstruiert Erfahrung rasche Denaturierung des Proteins, und viele der Zellen während der Abscheidung lysiert.
Derzeit neue Additive Manufacturing Bioprinting Methoden entwickelt worden. In diesen Systemen Zellen, Proteinen, Wachstumsfaktoren und biomimetische Hydrogele werden typischerweise in Matrix mater integriertenrialien während des Herstellungsprozesses und mit computergesteuerten Aktoren an dreidimensionalen Gerüst-basierte Zellbeladene Konstrukte, die die Mikroarchitektur des nativen genau imitieren erzeugen gleichzeitig abgeschieden. Die zellbeladenen Hydrogele bilden die bioink, die heterogen sein kann, die aus mehreren Zelltypen oder homogen. Additiv Fertigungssysteme Ablagerung bioink Tropfen für Tropfen oder Schicht-für-Schicht durch Einmalspritzen und Spitzen auf einem computergesteuerten Bühne bewegen kann, in der x, y und z-Richtungen. Durch Computer-Software, kann die Architektur der gedruckten Gerüste leicht manipuliert werden je nach Anforderung der Anwendung. Im Gegensatz zu herkömmlichen Techniken kann dreidimensionalen medizinischen Technologien (Magnetresonanztomographie, Computertomographie) in den Designs integriert werden, Erzeugen der patientenspezifischen Konstrukt. Diese Verfahren die Möglichkeit der Herstellung vaskularisierten Ersatz erlauben auch, weil Konstrukte werden mit einer höheren l hergestelltocal Zelldichte, wodurch Zell-Zell-Interaktionen und die Verbesserung der Wahrscheinlichkeit nach der Implantation Surviva.
Der Palmetto Printer ist ein speziell angefertigten dreidimensionalen Multi-Spendersystem, das programmierbare Roboter-Fertigungsverfahren verwendet, um dreidimensionale heterogene Gewebekonstrukte (Abbildung 1) zu erzeugen. Sie ermöglicht die Verwendung einer Vielzahl von Materialien in einer einzigartigen Kombination an heterogene Strukturen herzustellen. Die Initialisierung des bioprinter ist einer der wichtigsten Schritte bei der Bioprinting weil es Ihnen erlaubt, eine Vielzahl von Parametern, um die Bedruckbarkeit der bioprinted Konstrukte zu optimieren.
Die bioprinter umfasst einen Chargenprozess mit Inbetriebnahme, Betrieb und Abfahren Sequenzen durch eine speicherprogrammierbare Steuerung (SPS), die der Nutzer durch eine interaktive Touchscreen-Bedienfeld arbeitet (Abbildung 1, A) gesteuert. Um eine Verunreinigung von Bio verhindernlogische Materialien der bioprinter ist in einem positiv-Druck von Poly (methylmethacrylat) eingeschlossen (PMMA) Kammer mit einer Hocheffizienzpartikelrückhaltevermögen (HEPA) -filtered Luftzirkulationssystem (1, B, C). Das Innere des Druckers unter Verwendung der integrierten UV-Lichtquellen (1, D) zu sterilisieren. Die zentrale Komponente des bioprinter ist eine voll programmierbare Positionierung Roboter, der reproduzierbar platzieren können eine Spenderspitze mit einer Genauigkeit von 10 Mikrometern (Abbildung 1, E). Es gibt drei Abgabevorrichtungen, die in der Lage, Volumen so klein wie 230 nl Rotationsschraube (1, F) hinterlegen. Sie sind unabhängig programmierbare Verwendung separater Computer, Druckparameter regeln für jede Abgabevorrichtung (1, G). Drehschneckeabgabe nutzt die Drehbewegung eines Motors angetriebene Schnecke nach unten einer Spritze aus der Spritzenspitze bewegen bioink. Diese Spender werden auf eine pneumatische montiertly gesteuerten Bearbeitungskopf (2A, B), so dass der Roboter Zufuhr auf die Z-Achsen-Roboterarm unter Programmsteuerung (1, H) montiert zu schalten.
Die XYZ-Roboter empfängt Druckanweisungen von einem Computer-Design-Software (Abbildung 1, I). Jedes Programm enthält Abgabestellen, Kalibrierungsroutinen und Spender wechselnden Protokolle. Das Design der generierten Konstrukte besteht im Wesentlichen aus den XYZ-Koordinaten, wo jedes Spenders wird Material zu hinterlegen. Die bioprinter zwei optische Lichtsensoren (2C), die bestimmen, die XYZ-Koordinaten des Spritzenspitzenende. Diese Sensoren senden Koordinateninformationen an den Roboter, die diese verwendet, um Positionen der Spender Spitzenenden zu berechnen. Es wird eine zusätzliche Verschiebung Laser (2D), das eine 633 nm-Diode roten Laserstrahl der Punktgröße Projekte 30 x 100 Mikrometer, um Abstand mit einem Accura messency von 0,1 Mikrometern. Wenn der Strahl hoch konzentriert sich der Roboter bestimmt den Z-Abstand der Druckfläche. Diese Messung und die optische Lichtsensoren Messung des Spitzenendes in Z, erlaubt die Berechnung von genauen z-Koordinaten verwendet, um die Spenderspitze in Bezug auf die Druckoberfläche zu platzieren. Die Dispenser-Spitzen seitlich und vertikal zu bewegen durch die orientierte X-Achsen-optischen Lichtsensor, um die Y- und Z-Zentren zu finden, und sich seitlich durch einen Y-Achsen-Sensor, um die Mitte der X-Achse zu finden. Ax + by + cz = d zu bestimmen, wo die Oberfläche relativ zu der Position der Ausgabespitzenende ist: die Druckoberfläche wird unter Verwendung der Formel für eine flache Ebene im XYZ-Raum abgebildet. Der Drucker Stufe (1, J) enthält eine Proben-Petrischale bis zu 80 mm im Durchmesser und verwendet einen rezirkulierenden Wasserbades, um die Solltemperatur (1, K) zu erhalten. Bühnentemperatur kann in einem Bereich von -20 eingestellt werden und bleibt im Stall. Es gibt eine USB-Kamera montiertauf den Roboter Z-Arm, um eine vergrößerte Ansicht der Abgabespitze während des Druckprozesses (1, L) zu liefern. Es gibt eine zweite Kamera auf der Oberseite des Kammerinneren, die eine vollständige Ansicht des bioprinter während des Druckprozesses (Abbildung 1, L) bietet montiert.
Ein Computer-Aided-Design-Zeichensoftware bestimmt die Ablagerungsmuster und erlaubt es dem Benutzer, inkremental beabstandeten Tröpfchen und komplexen Strukturen (Figur 3) zu erzeugen. Dreidimensionale Wege können manuell in den Drucker-kompatible Design-Software codiert oder von einem separaten Computer-Aided Design Zeichensoftware (Abbildung 4, Tabelle 1) importiert werden. Der Drucker entwickelte Software Variationen von Druckparametern, wie beispielsweise der Niederschlagsverfahren (Einzeltröpfchenabscheidung oder kontinuierlichen Weg deposition), dreidimensionale Geometrie der Signalwege, Abscheidungsrate, der Abstand zwischen der Spitze der Spritze Ende und substRate Druckoberfläche, die Höhe der Zeit, eine individuelle Tropfen, und die Höhe zu hinterlegen und zu beschleunigen, die Spritze zwischen Abscheidung der Tropfen gehoben. Jedes Programm enthält XYZ Abgabestellen, Spitzenkalibrierungsroutinen und Spender wechselnden Protokolle, um eine sterile Umgebung während des Druckvorgangs zu schaffen, ohne Bedienereingriff. Die speicherprogrammierbare Steuerung (SPS) des Roboters empfängt Anweisungen von dem Computer mit der Design-Software und die Zeitsteuerung von Ereignissen von der externen Controller (beispielsweise die Abgabevorrichtungen). Um dies zu tun, verwendet die Steuerung eine Schleifenmechanismus, um die Abgabevorrichtungen zu steuern , Roboter-Positionierungseinrichtung und Umweltfaktoren.
Dreidimensionale Direktschreib Bioprinting Verwendung eines Rotationsschnecken, flüssige Abgabesystem ermöglicht, den Prozess der Abscheidung Zellen effizienter zu sein, genau und einfacher als bisherige Verfahren. Diese Studie zeigt, die angefertigten bioprinter der Lage ist, cell beladene Hydrogel-Konstrukte mit hoher Zelllebensfähigkeit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der primäre Fokus des Tissue Engineering ist es, die Lücke zwischen Organmangel und Transplantation Bedürfnisse durch die Entwicklung von biologischen Ersatzstoffe zur Wiederherstellung, Erhaltung oder Verbesserung der nativen Gewebe functio brücken. Dies hat zur direkten Herstellung von Gerüsten mit einem komplexen, anatomisch korrekte Außengeometrie und eine genaue Kontrolle über den internen geometr geführt. Dreidimensionale Bioprinting ist eine Methode zur Erzeugung von dreidimensionalen Konstrukte in versch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Unterstützung der Regierung unter Grant No EPS-0903795 von der National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), und Grant 8P20 GM103444 (YM PI) ausgezeichnet unterstützt.
Materials
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37°C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37°C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80°C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80°C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37°C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37°C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20°C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20°C until use |
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