Lönsamhet Bioprinted Cellular konstruktioner med hjälp av en tre Dispenser cartesianska skrivare
Summary
A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.
Abstract
Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.
Introduction
Tissue engineering använder principerna om biologi och teknik i utvecklingen av funktionella substitut för att behålla, återställa eller förbättra naturliga vävnaden och. Förmågan att generera tredimensionella biomimetiska konstruktioner på begäran skulle underlätta vetenskapliga och tekniska framsteg inom vävnadsregenerering samt i cellbaserade sensorer, drog / toxicitet screening, vävnad eller tumörmodeller och andra. Den tredimensionella organisationen av vävnadstekniska konstruktioner är en grundläggande del av tillverkningsmetoden eftersom det noga måste efterlikna den mycket organiserade samspelet mellan celler och extracellulär matris i naturliga vävnaden.
Bionedbrytbara och formbildande tredimensionella ställningar är kritiska faktorer vid alstring av nya vävnadskonstrukten eftersom celler migrerar för att bilda en två-dimensionell lager av celler, men saknar förmågan att växa i gynnad tre-dimensionella. Ställningen tjänar som en tillfällig grund för cellenkvarstad och spridning, så det måste vara konstruerad av material med kontrollerbar porositet och nedbrytbarhet och tillräcklig mekanisk integrit. De byggnadsställningsmaterial bör inte vara cytotoxiska eller skapa en ogynnsam respons från värden. Hydrogeler har vanligen används i vävnadsutvecklingstekniker, och på grund av deras hydrofilicitet, hydrogeler tillåta fluid och gasutbyte genom hela strukture. Genom att kombinera olika hydrogeler, den syntetiserade hydrogel egenskaper är modifierbara att uppfylla distinkt applikationskrav.
Den konventionella tissue engineering strategi innebär skapandet av acellulära porösa offer byggnadsställningar som är sådda med celler efter fabricatio. Många tekniker har använts, såsom fiberbindning, lösningsmedelsgjutning, och smältformning, men visade sig vara minimalt framgångsrika för vävnadstekniska tillämpningar. Fiberbindningsmetoder tillåter fibrerna att ligga i linje i specifika former, men de är endast i stånd att prorande av mycket tunna byggnadsställning. Lösningsmedel gjutmetoder produceras mycket porösa konstruktioner, men den största producerade membranet var endast 3 mm thic. Därför skapar tredimensionella konstruktioner inte är möjligt att använda dessa tekniker. Smältformning tekniker visat sig framgångsrik i att producera tredimensionella ställningar, men sådana höga temperaturer erfordras att biologiska material som inte kan införlivas under produktionen proces. Ställningar seedade efter tillverkning är begränsade i sin förmåga att uppfylla kraven i vävnadsteknik för att producera tredimensionella ställningar med fördefinierade eller kontrollerbara mikrostrukturer och. En annan viktig fråga med fasta ställnings sådd teknik är brist på vaskularisering och dålig mekanisk.
Bioprinting har sedan utökats till tre dimensioner genom användning av icke-toxiska, biologiskt nedbrytbara, termoreversibla geler för att övervinna nackdelarna med konventionella. Några av den fasta freeform tillverkning techniques närvarande används är laserassisterad bioprinting och bläckstråleutskrift. Laserassisterad bioprinting tekniker använder en pulsad laserkälla, en måltavla, och en mottagande substratet för att alstra tre-dimensionella. Emellertid är denna teknik begränsad på grund av låg genomströmning, låg cellviabilitet, och kan bara producera begränsade arrangemang av tillverkade strukturer eftersom endast fototvärbindbar prepolymerer kan användas för att bilda en tvärbunden hydrogel. Bläckstråleutskrifter utvecklades som en beröringsfri metod som återger digitala bilddata på ett substrat genom att deponera pikoliter bläck. Emellertid bläckstråleutskrifter inte kan uppvisa en hög upplösning konstruktet, konstruerar erfarenhet snabb proteindenaturering, och många av cellerna lyseras under avsättningen.
För närvarande har nya additiv tillverkning bioprinting metoder utvecklats. I dessa system celler, proteiner, tillväxtfaktorer och biomimetiska hydrogeler typiskt integrerade i matris materIALS under tillverkningsprocessen och samtidigt deponeras med hjälp av datorstyrda ställdon för att generera tredimensionella byggnadsställningar baserade cell lastat konstruktioner som är nära efterliknar mikroarkitektur av infödda. De cell lastad hydrogeler utgör bioink, som kan vara heterogen, som består av flera celltyper, eller homogena. Tillsats tillverkningssystem insättning bioink droppe för droppe eller skikt-vid-skikt via engångssprutor och tips på en datorstyrd stadiet med förmåga att röra sig i x-, y-, och z-riktningarna. Genom datorprogram, kan arkitekturen av tryckta ställningar lätt manipuleras beroende på applikationens krav. Till skillnad från konventionella tekniker, kan tredimensionella medicinteknik (magnetisk resonanstomografi, datortomografi) införlivas i de mönster, generera patientspecifika konstruktionen. Dessa metoder tillåter även möjligheten att producera vaskulariserade utbyten eftersom konstruktioner tillverkas med en högre lOCAL celldensiteten, vilket gör att cell-cell-interaktioner och förbättra sannolikheten för efter implantation surviva.
Palmetto Printer är en specialbyggd tredimensionell flera dispenser som använder programmerbara robot tillverkningsmetoder för att skapa tredimensionella heterogena vävnads konstruktioner (Figur 1). Det möjliggör användning av ett flertal material i unika kombinationer för att producera heterogena strukturer. Initieringen av bioprinter är ett av de viktigaste stegen i bioprinting eftersom det tillåter dig att ställa in en mängd parametrar för att optimera tryckbarhet av bioprinted konstruktionerna.
Den bioprinter innefattar en satsvis process med start, drift och avstängning sekvenser som styrs av en programmerbar logisk styrenhet (PLC), som användaren verkar genom en interaktiv pekskärm kontrollpanel (figur 1, A). För att förhindra kontaminering av biologisktlogiska material den bioprinter är inneslutna i en positivt pressad poly (metylmetakrylat) (PMMA) kammare med ett högeffektivt partikel arrestance (HEPA) filtrerat luftcirkulationssystem (figur 1, B, C). Interiören i skrivaren kan steriliseras med hjälp av den inbyggda ultravioletta ljuskällor (Figur 1, D). Den centrala komponenten i bioprinter är en fullt programmerbar positionerings robot som reproducerbart kan placera en fördelartoppen med en noggrannhet på 10 mikrometer (Figur 1, E). Det finns tre automater, som kan sätta volymerna så små som 230 nl hjälp av en skruv (Figur 1, F). De är oberoende av varandra är programmerbara med användning av separata datorer som styr utskriftsparametrar för varje automaten (figur 1, G). Roterande skruvdispense utnyttjar rotationen hos en motordriven skruv för att förflytta bioink ner en spruta och ut ur sprutspetsen. Dessa automater är monterade på en pneumatiskly kontrollerad Verktygs Nest (figur 2A, B), så att roboten att växla dispensern monteras på Z-axeln robotarm enligt programmerad styrning (fig 1, IH).
XYZ robot får utskriftsinstruktioner från en dator som kör design mjukvara (figur 1, I). Varje program innehåller dispense platser, kalibreringsrutiner och dispenser förändras protokoll. Utformningen av genererade konstruktioner främst består av XYZ-koordinater där varje dispenser kommer att deponera material. Den bioprinter består av två optiska ljussensorer (Figur 2C) som bestämmer XYZ-koordinaterna för sprutspetsen slutet. Dessa sensorer skickar samordna information till roboten, som använder dessa för att beräkna positionerna för dispenser spetsändarna. Det finns ytterligare en förskjutning laser (Figur 2D) som projicerar en 633 nm diod röd laserstråle med punktstorlek 30 x 100 mikrometer för att mäta avstånd med en Accuracy av 0,1 mikrometer. När strålen är mycket fokuserad roboten bestämmer Z avståndet mellan skrivytan. Denna mätning, och den optiska ljussensorer mätning av spetsänden i Z, tillåter beräkning av korrekt Z-koordinater används för att placera fördelartoppen i förhållande till tryckytan. Dispensern spetsar röra sig i sidled och vertikalt genom X-axeln orienterad optiska ljussensorn för att hitta de Y- och Z-centra, och lateralt genom en Y-axelsensor för att hitta mitten av X-axeln. Utskriftsytan avbildas med hjälp av formeln för en plan yta i xyz rymden: ax + by + cz = d för att avgöra där ytan är i förhållande till läget av dispenseringsspetsänden. Skrivarens steget (figur 1, J) håller ett prov petriskål upp till 80 mm i diameter och använder ett recirkulerande vattenbad för att bibehålla den inställda temperaturen (Figur 1, K). Stage Temperaturen kan ställas in inom ett intervall på -20 och förblir stabil inom. Det finns en USB-kamera monteradpå robot Z-armen för att åstadkomma en förstorad bild av tubens spets under tryckningsprocessen (fig 1, L). Det finns en andra kamera monterad mot toppen av kammarens inre som ger en komplett bild av bioprinter under tryckprocessen (fig 1, L).
En datorstödd design ritprogram bestämmer depositionsmönstret och tillåter användaren att generera stegvis fördelade droppar och komplexa strukturer (Figur 3). Tredimensionella banor kan manuellt kodas i skrivaren-kompatibel design mjukvara eller importeras från en separat datorstödd design ritprogram (Figur 4, Tabell 1). Skrivaren-kompatibel programvara tillåter variationer av tryckparametrar såsom deponeringsmetoden (enda droppavsättnings eller kontinuerlig väg avsättning), tredimensionell geometri vägar, avsättningshastighet, avstånd mellan sprutspetsen slutet och substhastighet tryckyta, den mängd tid för att avsätta en enskild droppe, och höjden och hastighet sprutan lyftes mellan avsättningen av dropparna. Varje program innehåller XYZ fördelnings platser, spets kalibreringsrutiner och dispenser förändrande protokoll för att ge en steril miljö, utan operatörsingripande, under tryckning. Den programmerbara logiska styrenheten (PLC) av roboten får instruktioner från datorn kör design mjukvara och styr tidpunkten för händelserna från externa styrenheter (t.ex. automater). För att göra detta, använder PLC en looping mekanism för att kontrollera automater , robotpositioneringsanordning, och miljömässiga faktorer.
Tredimensionell direktskriv bioprinting användning av en roterande skruv, vätskedispenseringssystem möjliggör processen för avsättning av celler för att vara mer effektiv, noggrann, och enklare än tidigare metoder. Denna studie visar den specialbyggda bioprinter är i stånd att alstra cell-lastad hydrogel konstruktioner med hög cellviabiliteten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det primära fokus för tissue engineering är att överbrygga klyftan mellan organbrist och transplantationsbehov genom att utveckla biologiska substitut som kan återställa, bibehålla eller förbättra naturliga vävnaden funge. Detta har lett till den direkta framställningen av byggnadsställningar med en komplex, anatomiskt korrekt extern geometri och exakt kontroll över den interna geometr. Tredimensionell bioprinting är en metod som används för att alstra tre-dimensionella konstruktioner av olika storlekar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av statligt stöd enligt Grant Nr EPS-0903795 tilldelas av National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), och Grant 8P20 GM103444 (YM PI).
Materials
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37°C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37°C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80°C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80°C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37°C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37°C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20°C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20°C until use |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. . Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Derby, B. Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Kachurin, A. M., et al. Direct-Write Construction of Tissue-Engineered Scaffolds. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 698, 10-1557 (2002).
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds. European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).
- Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F. Rapid Prototyping in Tissue Engineering. Challenges and Potential. Trends Biotechnol. 22 (12), 643-652 (2004).
- Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques. Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).
- Burg, K. J. L., Boland, T. Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing. IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Khalil, S., Nam, J., Sun, W. Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D. Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).
- Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries. Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).
- Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration. Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).
- Gruene, M., et al. Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions. Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).
- Khalil, S., Sun, W. Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs. J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).
- Xu, T., et al. Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).
- Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models. Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).
- Chung, J. H. Y., et al. Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering. Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).
- Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).
- Lu, L., Mikos, A. G. The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering. MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).
- Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
- Devillard, R., et al. Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting. Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).
- Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer. Gene Ther Reg. 6 (1), 33 (2011).
- Xu, T., et al. Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method. Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).
- Calvert, P. Inkjet Printing for Materials and Devices. Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).
- Li, M. G., Tian, X. Y. A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction. Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).
- Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).
- Rowley, J. A., Madlambaya, G. Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool. Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).
- Ozbolat, I., Yu, Y. Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes. Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).
- Jia, J., et al. Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).
- Forty, R. A., Steinberg, M. S. The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
- Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery. Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).
- El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges. Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).
- Smith, C. M., et al. Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs. Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).
- Ozbolat, I. T., Chen, H. Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs. Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X. Adv Mater. X, x-y (2014).
