Kanalen voor het transport van watermoleculen in enzymen beïnvloeden actieve plaats solvatatie en katalyse. Hierin presenteren we een protocol voor de engineering van deze extra katalytische motieven op basis van in silico computermodellen en experimenten. Dit zal ons begrip van de invloed van oplosmiddel dynamiek op enzymkatalyse verbeteren.
Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.
Water vormt een hoeksteen voor de chemie van het leven 1. Water patronen en solvatatie enzym actieve sites van invloed op zowel de enthalpie en entropie van ligandbinding 1,2 en katalyse 3 in een zeer complexe manier die verder reikt dan het hydrofoob effect 2,3. NMR 4, hebben calorimetrie 2 en moleculaire modellering van gesolvateerd eiwitten gebruikt om licht te werpen op de rol van expliciete watermoleculen in het verstrekken van een drijvende kracht voor het ligand vereniging 5-8, specificiteit en activiteit 2,9,10. Hierin stellen wij een unieke methode voor de experimentele evaluatie van de thermodynamische effecten oplosmiddel verplaatsing van enzym katalyse (figuur 1). Onze gecombineerde strategie is gebaseerd op het gebruik van computersimulaties in overleg met enzyme engineering en thermodynamische analyse (Figuur 1). Dit maakt het mogelijk voor het vergieten van extra licht op de invloed van oplosmiddel dynamiek op catalysis, die momenteel slecht begrepen.
Stabiliserende enthalpische interacties, die door water-gemedieerde waterstofbruggen in gesolvateerde enzym actieve plaatsen, kunnen worden gecompenseerd door entropische sancties 1. Deze entropische kosten worden geassocieerd met de afname van het aantal vrijheidsgraden weergegeven watermoleculen opgesloten binnen holtes eiwit, in vergelijking met water in bulk 5. De release van de bestelde watermoleculen kunnen leveren daarmee een entropische drijvende kracht voor ligand vereniging 1 en katalyse 3. Een belangrijk aspect oplosmiddel dynamiek is de verplaatsing van watermoleculen tussen het inwendige van proteïnen en buitenzijde oplosmiddel 4. De bijbehorende veranderingen in activeringsenergie, enthalpie en entropie 11 worden niet volledig begrepen op moleculair niveau. Door belemmeren afzonderlijke tunnels voor het transport van water in enzymen, het belang van oplosmiddel dynamiek en zijn bijdrage aan de activatieenergie kan worden geëvalueerd (figuur 1). Bovendien, door het uitvoeren van één-pot kinetische experimenten bij verschillende temperaturen, de relatieve thermodynamische activering parameters van meerdere substraten kunnen worden gewonnen uit een beperkt aantal experimenten (figuur 1, rechts). Onze interdisciplinaire methode is gevalideerd voor complexe membraangebonden triterpeen cyclase enzymen die polycyclische terpenen van groot belang voor het leven 12 genereren. Het protocol voorziet in de terugwinning van grote hoeveelheden membraaneiwit (10-20 mg / l) met een standaard centrifuge.
Hoewel enzymen geëvolueerd in water, wordt de rol van het oplosmiddel te bevorderen katalyse meestal verwaarloosd. Naast eiwit dynamiek 13,14 die vorm pre-georganiseerde actieve sites met elektrostatische complementariteit om de overgang staat op 15, kon water dynamiek zijn van groot belang voor een efficiënte enzymkatalyse. Door het smeden van verschillende interdisciplinaire technieken, onzeDoel is de zeer complexe onderzoek waterdynamica en thermodynamica vergemakkelijken. Deze instrumenten toegankelijker te maken voor de wetenschappelijke gemeenschap te maken zal leiden tot de ontwikkeling van nieuwe strategieën in enzym engineering en eiwit ontwerp voor veranderde activiteiten en specifieke kenmerken.
De meest kritische stappen bij het bereiken van hoge kwaliteit experimentele thermodynamische gegevens voor wildtype enzym membraan en tunnel varianten zijn: 1) generatie van het computermodel; 2) homogeen gezuiverde eiwitten; 3) geëmulgeerd substraat bestanden; 4) controle van de temperatuur tijdens kinetiek; 5) extractie van reactiemengsels met behulp van interne standaard.
Het genereren van het computermodel wordt sterk vergemakkelijkt door het gebruik van software met een user interface die verschillende platforms ondersteunt. Daarom wordt dit protocol gebaseerd op het Yasara modelleren suite 16 om onze strategie te bereiken zelfs voor het modelleren van niet-experts te maken. Een computermodel voor watertunnel identificatie moet idealiter basis van een kristalstructuur van het enzym van belang 24. Daartoe de rijkdom van kristalstructuren in de Protein Data Bank is zeer gunstig. In onze ervaring, een belangrijk aspect in de succesvolle voorbereiding van TEMplaten voor tunnel identificatie te kristallografische wateren houden. Het is even belangrijk een gesolvateerde enzym box gebruikt bij het uitvoeren van moleculaire dynamica simulaties, die kan worden uitgevoerd op een gewone computer. De triterpene cyclase uit Alicyclobacillus acidocaldarius is stabiel in het water tijdens de MD-simulaties 3. Maar door kristallografische detergentia en / of gebruiken celmembraan nabootst zou wellicht vereist voor potentieel onstabiele enzymen zorgen voor langere MD-simulaties. Het wordt voorzien dat het geminimaliseerde kristalstructuur van zeer uitdagende doelen belangrijk mechanistisch inzicht zou kunnen bieden met behulp van het protocol, hoewel dit niet dynamische aspecten van de tunnel organisatie zou veroveren.
CAVER 19 in de basis staat, met een enkele of een beperkt aantal snapshots als input kunnen worden gebruikt door niet-deskundigen op een standaard laptop. Gebaseerd op onze ervaring 3, tunnels met een straal bottleneck (dat wil zeggen, de straalop het smalste punt) kleiner dan 1 A kan worden zeer relevant voor het water, vooral als kristallografische watermoleculen bevinden binnen de voorspelde tunnel (Figuur 1, midden links). Anderzijds kan een grotere radius bottleneck een tunnel voor het transport van het substraat in en uit de actieve plaats 10 impliceren. Het script aanvullende codebestand 2 kan worden gebruikt door niet-deskundigen voor de visualisatie van voorspelde tunnels. Toekomstige experimenten zal uitwijzen of homologie modellen van voldoende hoge resolutie zal zijn om te zorgen voor de atomistische studie van waternetwerken en dynamiek. Belichten hoe het uitvoeren moleculaire dynamica simulaties met en zonder een ligand aanwezig in de actieve plaats, beïnvloedt het proces van tunnel identificatie ook van belang zijn.
Kinetiek van membraaneiwitten kan een enorme uitdaging 25 vormen. Het protocol uitvinding is gebaseerd op een eenvoudig membraanextractie protocolhet membraan enzym zonder het gebruik van dure uitrusting, krijgen bijvoorbeeld een ultracentrifuge. Het gebruik van gelfiltratie als laatste polishing stap verwijdert potentiële residuele membraan deeltjes en maakt een passend reinigingsmiddel omgeving 25.
Een belangrijk aspect bij het bereiken van reproduceerbare kinetische resultaten van het protocol is om de substraat voorraad oplossing door ultrasone trillingen emulgeren. Eenvoudige wervelen hydrofobe substraten verdund in reactiebuffer geeft homogeen substraat-detergent mengsels. Het pipetteren van niet-geëmulgeerde substraatoplossingen leidt tot reproduceerbare concentraties (bevestigd door kwantitatieve GC), die nauwkeurige bepaling van beginsnelheden voorkomt. Daarentegen dient het pipetteren van goed geëmulgeerd voorraadoplossingen leiden tot lineaire regressieanalyse van beginsnelheden met R2 in het bereik van 0,98-0,99. Een ander belangrijk aspect van hydrofobe substraten is de schijnbare oplosbaarheid substraaten de beschikbaarheid in het substraat-detergent mengsels. In feite was het niet mogelijk de triterpeen cyclase met referentiesubstraat squaleen verzadigen. Daarom blijkt kcat / Km waarden middelen zijn die bijdragen van bindende en chemie kunnen bevatten. Toch is gebleken dat de chemie is snelheidsbepalend voor kcat / KM voor polycyclization cascade uitgevoerd door triterpeen cyclases 3.
Het is van groot belang voor de actuele temperatuur in een reactie glazen flesje verifiëren met een externe thermometer. Toch kunnen lineaire fits armer varianten essentiële constante schijnbare kcat / Km waarden bij verschillende temperaturen. Dit wordt benadrukt de S168F variant hierin (figuur 2A) met een activering enthalpie dicht bij nul (figuur 2B en 2C). Erg small temperatuurafhankelijke veranderingen in schijnbare k cat / K M, kan onzekerheid in de waargenomen activatie entropie induceren Δ S ‡ (dwz het snijpunt van de lineaire plots figuur 2B). In principe zou de waargenomen activatie entropie ook beïnvloed worden door een andere overvloed van actieve enzymen voor verschillende varianten, die niet wordt gedetecteerd door meting van de eiwitconcentratie. Verwacht wordt dat experimentele fouten worden gereduceerd bij het mengen meerdere substraten in één pot. Dit is omdat alle verschillende substraten interageren met dezelfde hoeveelheid enzym onder deze omstandigheden (vergelijking 4). Het gebruik van een extractieoplosmiddel verrijkt met een interne standaard rekening worden gehouden met verschillen in extractie en / of GC-injectie.
Transitietoestandstheorie is met succes gebruikt in Enzymology 26. Deze belangrijke theoretisch kader was oorspronkelijk dewikkeld voor unimoleculaire reacties in de gasfase. Echter is gebleken dat vooral enzymen werken door verlaging van de klassieke activatie energiebarrière 26. De transmissie coëfficiënt verondersteld één hierin zijn van invloed kunnen zijn de gemeten activering enthalpie en / of entropie. De bijdrage van tunneling en andere niet-klassieke effecten zoals recrossing van de overgangstoestand, ruwweg bijdragen 1000-voudig tot katalyse 26 overeenkomend met ongeveer 4 kcal / mol energie. Te zien is dat de activatie entropie weergegeven door het wild-type enzym (16 kcal / mol bij 328 K, figuur 2C) is veel groter dan die van niet-klassieke effecten veroorzaakt door een ongelijkmatige overdracht coëfficiënt. De impact van de transmissie-coëfficiënt zou afnemen bij het vergelijken van thermodynamische parameters van de activering van wild-type en de tunnel varianten met behulp van het protocol.
De Gibbs vrije energie van de activering (Δ G ‡) is composed van zowel een enthalpische (Δ H ‡) en een entropische (- T * Δ S ‡) termijn. Oplosmiddel reorganisatie in enzymen tijdens katalyse kunnen beide parameters beïnvloeden. Verwacht wordt dat het huidige protocol voor de studie van deze fenomenen te vergemakkelijken door het samenstellen van een toolbox van relevante en gebruiksvriendelijke in silico computationele gereedschappen met de nodige biofysische experimentele kader. De werkwijze is overwogen bruikbaar voor het bestuderen van een overvloed aan enzymatische processen, waaronder katalyse door membraangebonden enzymen zijn.
The authors have nothing to disclose.
The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.
YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |