Kanäle für den Transport von Wassermolekülen in Enzymen beeinflussen aktiven Stelle Solvatation und Katalyse. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Engineering dieser zusätzlichen katalytischen Motive auf In-silico-Computer-Modellierung und Experimenten. Dies wird unser Verständnis des Einflusses der Lösungsmitteldynamik auf Enzymkatalyse.
Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.
Wasser bildet einen Grundstein für die Chemie des Lebens 1. Wasser-Muster und Solvatation der aktiven Zentren von Enzymen wirken sich sowohl auf die Enthalpie und Entropie der Ligandenbindung 1,2 und Katalyse 3 in einem sehr komplexen Art und Weise über den hydrophoben Effekt 2,3 erstreckt. NMR 4, Kalorimetrie 2 und molekulare Modellierung solvatisierter Proteine verwendet worden, um Licht auf die Rolle der explizite Wassermoleküle in die eine treibende Kraft für die Ligand-Assoziations 5-8, Spezifität und Aktivität 2,9,10 vergießen. Wir beschreiben hier eine einzigartige Methodologie für die experimentelle Bestimmung der thermodynamischen Wirkung des Lösungs Verschieben auf Enzymkatalyse (Abbildung 1). Unsere kombinierte Strategie basiert auf der Verwendung von Computersimulationen im Konzert mit Enzym-Engineering und thermodynamische Analysen (Abbildung 1) basiert. Dies ermöglicht vergießen zusätzliches Licht auf die Auswirkungen der Lösedynamik auf cataLyse, die derzeit wenig verstanden wird.
Stabilisierende enthalpische Wechselwirkungen, durch Wasser vermittelte Wasserstoffbrücken in solvatisierten aktiven Zentren von Enzymen zur Verfügung gestellt, kann durch entropischen Sanktionen 1 ausgeglichen werden. Diese entropischen Kosten mit der Abnahme der Freiheitsgrade von im Protein Hohlräume beschränkt ist, Wassermoleküle angezeigt wird, wie in Groß 5 im Vergleich zu Wasser verbunden. Die Freisetzung von geordneten Wassermoleküle können somit einen entropischen Triebkraft für Ligand-Assoziations 1 und 3 der Katalyse. Ein Schlüsselaspekt der Solvatationsdynamiken ist die Verschiebung von Wassermolekülen zwischen dem Inneren der Proteine und der Außen Lösungsmittel 4. Die damit einhergehenden Veränderungen in der Aktivierungsenergie, Enthalpie und Entropie 11 nicht vollständig auf molekularer Ebene zu verstehen. Durch Behinderung einzelnen Tunnel für den Transport von Wasser in Enzymen der Bedeutung Solvatationsdynamiken und dessen Beitrag zur Aktivierung verantwortlichEnergie kann ausgewertet werden (Abbildung 1). Darüber hinaus wird durch Durchführen einer Eintopf kinetischen Experimenten bei verschiedenen Temperaturen Die relativen thermodynamischen Aktivierungsparameter mehrere Substrate können aus einer reduzierten Anzahl von Experimenten (Figur 1, rechts) extrahiert werden. Unser interdisziplinäres Verfahren für komplexe membrangebundenen Triterpen-Cyclase-Enzyme, die polycyclischen Terpenen der für das Leben 12 einen hohen Stellenwert zu generieren validiert. Das Protokoll ermöglicht die Gewinnung von großen Mengen an Membranprotein (10-20 mg / l) unter Verwendung einer herkömmlichen Zentrifuge.
Obwohl Enzyme in Wasser entwickelt hat, wird die Rolle des Lösungsmittels bei der Förderung der Katalyse in der Regel vernachlässigt. Neben der Proteindynamik 13,14, die Form vor, eine organisierte aktive Stellen mit elektrostatischen Komplementarität zu den Übergangszustand 15, könnte Wasser Dynamik für eine effiziente Enzymkatalyse hoher Bedeutung sein. Durch Schmieden mehrere interdisziplinäre Methoden, unsereZiel ist, die hoch komplexe Untersuchung der Wasserdynamik und der Thermodynamik zu erleichtern. Machen diese Werkzeuge leichter zugänglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft wird zur Entwicklung neuer Strategien in der Enzymtechnik und Proteindesign für veränderte Aktivitäten und Spezifitäten führen.
Die wichtigsten Schritte bei der Erreichung hoher Qualität experimentellen thermodynamischen Daten für Wildtyp-Enzym-Membran und Tunnelvarianten sind: 1) Generation der Computer-Modell; 2) homogen gereinigte Proteine; 3) emulgiert Substrat Bestände; 4) Kontrolle der Temperatur während der Kinetik; 5) Extraktion von Reaktionsgemischen mit Hilfe interner Standard.
Die Erzeugung des Computermodell wird durch die Verwendung einer Software mit einer benutzerfreundlichen Schnittstelle, die eine Vielzahl von Plattformen unterstützt erleichtert. Daher wird dieses Protokoll auf der YASARA Modellierung suite 16 voraus unserer Strategie zugänglich, auch die Modellierung Nicht-Experten zu machen. Ein Computermodell für die Wassertunnel Identifikation sollte idealerweise auf einer Kristallstruktur des Enzyms von Interesse 24 basieren. Zu diesem Zweck ist der Reichtum der Kristallstrukturen in der Proteindatenbank sehr vorteilhaft. Nach unserer Erfahrung ein wichtiger Aspekt bei der erfolgreichen Herstellung von TEMPlatten für die Tunnelidentifikations ist kristallographischen Wasser zu halten. Es ist ebenso wichtig, um einen gelösten Enzyms Feld verwenden bei der Durchführung von Moleküldynamiksimulationen, die auf einem normalen Computer ausgeführt werden können. Die Triterpen-Cyclase aus Alicyclobacillus acidocaldarius ist während der MD-Simulationen 3 in Wasser stabil. Allerdings halten kristallographischen Detergenzien und / oder mit Zellmembran imitiert wäre vielleicht für potenziell instabilen Enzymen erforderlich sein, um für längere MD-Simulationen zu ermöglichen. Es ist vorgesehen, dass das minimierte Kristallstruktur von höchst anspruchsvollen Ziele könnten wichtige mechanistische Einblicke liefern unter Verwendung des Protokolls, auch wenn dies nicht dynamische Aspekte der Tunnel Organisation zu erfassen.
CAVER 19 in der Grundmode mit einem einzigen oder einer begrenzten Anzahl von Snapshots als Eingang kann durch Nicht-Experten auf einem Standard-Laptop verwendet werden. Basierend auf unserer Erfahrung 3, Tunnel mit einer Engpass Radius (dh der Radiusan der engsten Stelle) kleiner als 1 Å für Wasser von hoher Relevanz sein, besonders wenn kristallographischen Wassermoleküle befinden sich innerhalb der vorhergesagten Tunnel (Abbildung 1, Mitte links). Andererseits könnte ein größerer Radius Engpass eines Tunnels für den Transport des Substrats in den und aus dem aktiven Zentrum 10 bedeuten. Das Skript in Ergänzungscodedatei 2 kann durch Nicht-Experten für die Visualisierung von vorhergesagten Tunnel verwendet werden. Zukünftige Experimente werden zeigen, ob Homologie-Modelle werden mit ausreichend hoher Auflösung sein, für die atomistische Untersuchung von Wassernetzen und Dynamik zu ermöglichen. Licht auf, wie die Durchführung Moleküldynamiksimulationen, mit und ohne in der aktiven Stelle vorhandenen Liganden beeinflusst der Prozess der Tunnelidentifikations würde auch von Bedeutung sein.
Kinetik der Membranproteine können eine gewaltige Herausforderung 25 bilden. Das Protokoll wird hierin auf eine einfache Membranextraktionsprotokoll basierendum die Membran Enzym ohne die Verwendung von teurer Ausrüstung, wie zum Beispiel einer Ultrazentrifuge erhalten. Die Verwendung von Gelfiltration als Endpolierschritt beseitigt potenzielle Restmembranpartikeln und ermöglicht die Festlegung eines geeigneten Reinigungsmittel Umwelt 25.
Ein wesentlicher Aspekt bei der Erreichung reproduzierbarer Kinetik ergibt sich aus der Protokoll ist, das Substrat-Stammlösung durch Ultra emulgieren. Einfache Verwirbeln von hydrophoben Substraten in dem Reaktionspuffer verdünnt gibt inhomogene Substrat-Detergensgemische. Das Pipettieren der nicht emulgierten Substratlösungen führt zu reproduzierbaren Konzentrationen (durch quantitative GC bestätigt), die genaue Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten verhindert. Im Gegensatz dazu sollte das Pipettieren von richtig emulgiert Stammlösungen in linearen Regressionsanalyse der Anfangsgeschwindigkeiten mit R 2 im Bereich von 0,98 bis 0,99 führen. Ein weiterer wichtiger Aspekt von hydrophoben Substraten ist die scheinbare Löslichkeit des Substratsund die Verfügbarkeit in den Substrat-Detergensgemische. Tatsächlich war es nicht möglich, die Triterpen-Cyclase mit dem Referenzsubstrat Squalen sättigen. Aus diesem Grund ersichtlich, k cat / K M -Werte werden hier vorgestellt, die Beiträge der beiden Bindungs und Chemie enthalten könnten. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass die Chemie Ratenbegrenzung für k cat / K M für die Polycyclisierung Kaskade von Triterpen-Cyclasen 3 durchgeführt.
Es ist von großer Bedeutung, um die tatsächliche Temperatur innerhalb einer Reaktionsglasfläschchen mit einem Außenthermometer verifizieren. Dennoch können lineare fits ärmer Varianten mit wesentlichen konstanten scheinbaren k cat / K M-Werte bei verschiedenen Temperaturen zu sein. Dies ist für den S168F Variante hierin (2A) mit einem Aktivierungs Enthalpie nahe Null (2B und 2C) betont. Sehr kleinel temperaturabhängige Änderungen der scheinbaren k cat / K M, könnte Unsicherheit in der beobachteten Aktivierungsentropie induzieren Δ S ‡ (dh der Schnittpunkt in den linearen Grundstücke in 2B). Im Prinzip könnte die beobachtete Aktivierung Entropie auch durch eine unterschiedliche Häufigkeit von aktiven Enzymen für verschiedene Varianten, die nicht durch die Messung der Proteinkonzentration detektiert werden würde beeinträchtigt werden. Es wird erwartet, dass die experimentellen Fehler werden reduziert, wenn Mischen mehrerer Substrate in einer Eintopfreaktion. Dies liegt daran, dass alle verschiedenen Substraten in Wechselwirkung mit der gleichen Menge an Enzym unter diesen Umständen (Gleichung 4). Die Verwendung eines Extraktionslösungsmittels versetzt mit einem internen Standard ist wichtig, um Unterschiede bei der Extraktion und / oder GC-Einspritzung zu berücksichtigen.
Eyring-Theorie wurde erfolgreich in Enzymology 26 verwendet. Diese wichtige theoretische Rahmen wurde ursprünglich deentwickelt für unimolekulare Reaktionen in der Gasphase. Allerdings hat es sich gezeigt, dass Enzyme vor allem durch Absenken des klassischen Aktivierungsbarriere 26 zu arbeiten. Die Durchgangskoeffizient angenommen, eine hierin könnte den gemessenen Aktivierungsenthalpie und / oder Entropie beeinflussen. Der Beitrag von Tunneln und anderen nichtklassischen Wirkungen wie Rückkreuzung des Übergangszustands, können grob 1000-fach bis 26-Katalyse entsprechend ca. 4 kcal / mol in Energie beitragen. Es kann gesehen werden, dass die Aktivierung der Entropie durch das Wildtyp-Enzym (16 kcal / mol bei 328 K, 2C) angezeigt wird, viel größer als eine solche nicht-klassischen Effekte einer ungleichmäßigen Übertragungskoeffizienten bewirkt. Die Auswirkungen des Durchgangskoeffizient sollte beim Vergleich von thermodynamischen Parameter der Aktivierung für Wildtyp und Tunnelvarianten unter Verwendung des Protokolls verringern.
Die Gibbs-Aktivierungsenergie (Δ G ‡) ist COMPOsed sowohl ein enthalpischen (Δ H ‡) und einer entropischen (- T * Δ S ‡) tigen. Beide Parameter können Lösungsmittel Reorganisation in Enzymen während der Katalyse beeinflussen. Das vorliegende Protokoll wird erwartet, dass die Untersuchung dieser Phänomene durch Zusammenfügen einer Toolbox von relevanten und benutzerfreundlich in silico Rechenwerkzeuge mit der notwendigen biophysikalischen experimentellen Rahmen zu erleichtern. Das Verfahren ist vorgesehen für die Untersuchung einer Vielzahl enzymatischer Prozesse, einschließlich Katalyse von membrangebundenen Enzymen.
The authors have nothing to disclose.
The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.
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Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
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