Каналы для транспортировки молекул воды в ферментов влиять активное сольватацию сайта и катализ. В этом мы приводим протокол для техники этих дополнительных каталитических мотивов, основанных на в силикомарганца компьютерного моделирования и экспериментов. Это позволит повысить наше понимание влияния динамики растворителя на ферментативного катализа.
Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.
Вода является краеугольным камнем для химии жизни 1. Водные узоры и сольватации ферментных активных сайтах влиять как на энтальпии и энтропии связывания лиганда 1,2 и катализ 3 в весьма сложным образом, выходящих за пределы гидрофобного эффекта 2,3. ЯМР 4, 2 и калориметрии молекулярное моделирование белков сольватированными были использованы, чтобы пролить свет на роль явных молекул воды в предоставлении движущей силой для лиганда ассоциации 5-8, специфичности и активности 2,9,10. В этом мы представляем уникальную методику для экспериментальной оценки термодинамической воздействия перемещения растворителя на ферментативного катализа (рис 1). Наша объединенная стратегия основана на использовании компьютерного моделирования совместно с ферментом техники и термодинамического анализа (рисунок 1). Это позволяет пролить дополнительный свет на воздействие динамики растворителя на CATAлизис, который в настоящее время мало изучены.
Стабилизация энтальпической взаимодействия, предусмотренные воды опосредованной водородных связей в сольватированы ферментных активных сайтах, может быть компенсировано энтропийных штрафов 1. Эти энтропийные затраты связаны с уменьшением степени свободы, отображаемого молекул воды заключены в белковых полостей, по сравнению с водой в объеме 5. Релиз молекул воды могут упорядоченных таким образом, обеспечить энтропийную движущую силу для лиганда ассоциации 1 и катализа 3. Одним из ключевых аспектов динамики растворитель представляет собой смещение молекул воды между внутренней и белков внешней растворителя 4. Прилагаемые изменения в энергии активации, энтальпия, энтропия и 11 полностью не поняты на молекулярном уровне. По воспрепятствование отдельные тоннели, ответственных за транспорт воды в ферментов, значение динамики растворителей и его вклад в активациюэнергия может быть оценена (рисунок 1). Кроме того, путем выполнения в одном реакторе кинетические опыты при разных температурах, относительные термодинамические параметры активации нескольких подложек могут быть извлечены из уменьшенного количества экспериментов (фиг.1, справа). Наша междисциплинарная метод утверждена для сложных мембраносвязанных ферментов тритерпеновый циклазу, которые генерируют полициклические терпены высокой важности для жизни 12. Протокол позволяет для восстановления больших количеств белка (мембраны 10-20 мг / л) с использованием стандартного центрифуги.
Хотя ферменты развивались в воде, роль растворителя в продвижении катализ, как правило, пренебрегают. В дополнение к динамике белка 13,14, что форма предварительно организованных активных сайтов с электростатическим взаимодополняемости в переходном состоянии 15, динамика воды может быть большое значение для эффективного ферментативного катализа. По ковки несколько междисциплинарных методов, нашЦель заключается в содействии весьма комплексное изучение динамики водных и термодинамики. Внесение этих инструменты более доступными для научного сообщества приведет к разработке новых стратегий в фермента инженерии и белкового дизайна для измененных деятельности и специфики.
Наиболее важные шаги в достижении высокого качества экспериментальных термодинамических данных для дикого типа мембраны ферментов и туннельных вариантов: 1) генерация компьютерной модели; 2) равномерно очищенные белки; 3) эмульсию запасы субстрата; 4) контроль температуры во время кинетики; 5) добыча реакционных смесей с использованием внутреннего стандарта.
Поколение компьютерной модели значительно облегчается при использовании программного обеспечения с дружественным интерфейсом, который поддерживает различные платформы. Следовательно, этот протокол основывается на YASARA Modeling Suite 16, чтобы наша стратегия доступна даже к моделированию неспециалистов. Компьютерная модель для идентификации вода туннеля в идеале должна быть основана на кристаллической структуре интерес фермента 24. Для этой цели богатый кристаллическими структурами доступны в банке данных белков является очень полезным. По нашему опыту, ключевой аспект в успешной подготовке ТЕАПластины для идентификации туннеля, чтобы сохранить кристаллографических воды. Это не менее важно, чтобы использовать сольватированную фермента окно при выполнении молекулярного моделирования динамики, которые могут быть запущены на обычный компьютер. Тритерпеновые циклаза от Alicyclobacillus acidocaldarius стабилен в воде в течение МД 3. Тем не менее, сохраняя кристаллографических моющие средства и / или с использованием клеточной мембраны имитирует бы, возможно, потребуется для потенциально нестабильных ферментов, чтобы в течение длительного МД. Предполагается, что минимизируется кристаллическая структура высоко сложных целей может предоставить важную механистическую представление с использованием протокола, хотя это не будет захватывать динамических аспектов туннельного организации.
Спелеолог 19 в базовом режиме, с одной или ограниченного числа снимков в качестве вклада, могут быть использованы неспециалистами на стандартном ноутбуке. Основываясь на нашем опыте 3, тоннелей с радиусом узкого (т.е., радиусна самом узком месте) меньше, чем 1 А может быть весьма актуальны для воды, особенно если кристаллографические молекулы воды находятся в пределах предсказанного туннеля (рис 1, средний левый). С другой стороны, больший радиус узким может означать туннель для транспортировки подложки в и из активного сайта 10. Сценарий в дополнительном файле кода 2 может быть использован лицами, не являющимися специалистами для визуализации предсказанных туннелей. Дальнейшие эксперименты покажут, будет ли модели гомологии быть достаточно высоким разрешением, чтобы позволить атомистической исследования водных сетей и динамики. Пролить свет на выполнении моделирования молекулярной динамики, с и без лиганда в активном центре, влияет на процесс идентификации туннеля будет иметь значение также.
Кинетика мембранных белков может представлять собой сложную задачу 25. Протокол в данном документе основана на протоколе экстракции простым мембраныдля получения мембранного фермента без использования дорогостоящего оборудования, такого как ультрацентрифуге. Применение гель-фильтрации в качестве конечной стадии полировки удаляет частицы остаточного потенциальных мембраны и обеспечивает определении соответствующей среды моющего 25.
Ключевым аспектом в достижении воспроизводимые результаты кинетических от протокола является эмульсию субстрата маточного раствора ультразвуком. Простой вортексе гидрофобных субстратов разбавленных в реакционном буфере дает неоднородные субстрат-моющих смесей. Пипетирующем не-эмульгированных решений субстрата приводит к невоспроизводимых концентрациях (подтвержденных количественного GC), что предотвращает точное определение начальных ставок. В противоположность этому, пипетки надлежащим эмульгированных растворов должно привести к линейной регрессии начальных скоростей с R 2 в диапазоне 0.98-0.99. Еще один важный аспект гидрофобных субстратов является очевидным растворимость субстратаи наличие в субстрат-моющих смесей. На самом деле, это не было возможно, чтобы насытить тритерпеновых циклазу со ссылкой подложки сквалена. По этой причине очевидно, К кот / значения К М представлены здесь, которые могут содержать вклады от обоих связывания и химии. Тем не менее, было показано, что химия ограничение скорости для к кошке / К М для polycyclization каскада, проведенного тритерпеновых циклаз 3.
Это имеет большое значение для проверки фактической температуры внутри реакция стеклянном флаконе с внешним термометром. Тем не менее, линейные подходит может быть беднее для вариантов с необходимым постоянных очевидно K CAT / значений К м при различных температурах. Это подчеркнуто для варианта S168F в данном документе (фиг.2А) с энтальпией активации, близкой к нулю (рис 2В и 2С). Очень Смальл в зависимости от температуры изменения в видимой К кошки / К М, может вызвать неопределенность в наблюдаемой энтропии активации Δ S ‡ (т.е. перехват в линейных участков на рисунке 2B). В принципе, наблюдаемый энтропии активации может также зависеть от другого обилие активных ферментов для различных вариантов, которые не будут обнаружены путем измерения концентрации белка. Ожидается, что экспериментальные ошибки уменьшаются при смешивании несколько подложек в одном горшке. Это потому, что все различные субстраты взаимодействуют с таким же количеством фермента в этих условиях (уравнение 4). Использование экстракционным растворителем с шипами внутренний стандарт важно для учета различий в процессе экстракции и / или GC-инъекции.
Государственная теория Переход был успешно использован в энзимологии 26. Это важное теоретическое основа была изначально детых для мономолекулярных реакций в газовой фазе. Тем не менее, было показано, что ферменты в основном работают за счет снижения классического активации энергетический барьер 26. Коэффициент передачи считать один насто щем описании может повлиять на измеряемую энтальпии активации и / или энтропии. Вклад туннелирования, и другие неклассические эффекты, такие как повторного пересечения переходного состояния, может способствовать примерно в 1000 раз катализа 26 соответствует примерно 4 ккал / моль энергии. Видно, что энтропия активации отображается на ферментом дикого типа (16 ккал / моль при 328 К, рис 2С) гораздо больше, чем таких неклассических эффектов, вызванных неоднородным коэффициентом пропускания. Влияние коэффициента передачи должна уменьшаться при сравнении термодинамических параметров активации для дикого типа и туннельных вариантов, использующих протокол.
Свободная энергия Гиббса активации (Δ G ‡) является компоSed обоих в энтальпической (Δ H ‡) и энтропийных (- Т * Δ S ‡) срок. Растворитель реорганизация ферментов во катализа может влиять на оба параметра. Настоящий Протокол, как ожидается, облегчить изучение этих явлений путем сборки соответствующих инструментов и удобный в кремнии вычислительных средств с необходимой биофизической экспериментальной базы. Способ предусмотрено полезными при изучении множество ферментативных процессов, в том числе катализе мембраносвязанных ферментов.
The authors have nothing to disclose.
The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.
YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |