酵素中の水分子の輸送のためのチャネルは、活性部位の溶媒和と触媒作用に影響を与えます。ここで我々は、 シリココンピュータモデリングと実験に基づいて、これらの追加の触媒モチーフのエンジニアリングのためのプロトコルを提示します。これは、酵素触媒の溶剤ダイナミクスの影響についての我々の理解を向上させます。
Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.
水は生命1の化学のための礎を構成しています。水のパターンと酵素活性部位の溶媒和は、疎水性効果2,3を越えて延びる非常に複雑な方法で1,2および触媒3リガンド結合のエンタルピーとエントロピーの両方に影響を与えます。 NMR 4は 、熱量2及び溶媒和タンパク質の分子モデリングは、リガンド会合5-8、特異性および活性2,9,10の駆動力を提供する際に、明示的な水分子の役割を解明するために使用されています。ここで我々は、酵素触媒反応の溶媒置換の熱力学的影響( 図1)の実験的評価のためのユニークな方法論を提示します。私たちの組み合わせ戦略は、酵素工学、熱力学解析( 図1)と協調してコンピュータシミュレーションを使用することに基づいています。これはCATAの溶剤ダイナミクスの影響に追加の光を流しを可能にします現在よく理解されていない溶解、。
溶媒和酵素活性部位中の水媒介性水素結合によって提供されるエンタルピー相互作用を安定化、エントロピーペナルティー1によって相殺することができます。バルク5内の水と比較して、これらのエントロピーコストは、タンパク質の空洞内に閉じ込められた水分子によって表示される自由度の低下と関連しています。注文した水の分子の放出は、このように、リガンドアソシエーション 1および触媒3のためのエントロピー駆動力を提供することができます。溶剤ダイナミクスの重要な側面は、タンパク質の内部と外部の溶媒4との間に水分子の変位です。活性化エネルギー、エンタルピー、エントロピー11で添付の変更が完全に分子レベルで理解されていません。個々の酵素の水の輸送を担当するトンネル、溶剤ダイナミクスの重要性と活性化への貢献を妨害することにより、エネルギーは、( 図1)を評価することができます。また、異なる温度でワンポット動態実験を行うことによって、いくつかの基板の相対的な熱力学活性化パラメータは、実験の数の減少( 図1、右)から抽出することができます。私たちの学際的な方法は、生活のための12重要度の高い多環式テルペンを生成する複雑な膜結合型トリテルペンシクラーゼ酵素のために検証されます。プロトコルは、標準的な遠心機を用いて、膜タンパク質の多量(10~20ミリグラム/ L)の回収を可能にします。
酵素が水に進化しているが、触媒反応を促進する溶剤の役割は、通常は無視されます。形状が遷移状態15に静電相補性を有する活性部位を事前に組織タンパク質のダイナミクス13,14に加えて、水のダイナミクスは、効率的な酵素触媒のための非常に重要である可能性があります。いくつかの学際的な技術を鍛造することにより、私たちの目的は、水力学と熱力学の非常に複雑な研究を促進することです。科学界へのこれらのツールは、よりアクセスしやすくすると、変更された活動や特異用酵素工学、タンパク質設計における新たな戦略の開発につながります。
野生型膜酵素とトンネルの変形のための高品質な実験熱力学データを達成する上で最も重要な手順は次のとおりです。コンピュータモデルの1)の生成; 2)均一に精製されたタンパク質; 3)基板の株式を乳化。 4)反応速度の際の温度を制御します。 5)内部標準を用いて反応混合物を抽出します。
コンピュータモデルの生成が大幅にさまざまなプラットフォームをサポートし、ユーザーフレンドリーなインターフェイスを持つソフトウェアを使用することによって促進されます。したがって、このプロトコルはあっても、非専門家をモデル化する当社の戦略にアクセスできるようにするYASARAモデリングスイート16を前提としています。水トンネル識別するためのコンピュータ・モデルは、理想的には、関心24の酵素の結晶構造に基づくべきです。この目的のために、タンパク質データバンクで利用可能な結晶構造の豊富で非常に有益です。我々の経験、TEMの調製に成功した中で重要な側面でトンネル識別用のプレートは、結晶水を維持することです。これは、通常のコンピュータ上で実行することができ、分子動力学シミュレーションを実行する際に溶媒和酵素ボックスを使用することが等しく重要です。 アリアシドカルダリウスからトリテルペン酸シクラーゼは、MDシミュレーション3の間に水に安定しています。しかし、結晶の界面活性剤を保持および/または細胞膜模倣物を使用して、おそらく、拡張MDシミュレーションを可能にするために潜在的に不安定な酵素のために必要とされるであろう。これは、トンネル組織の動的な側面を捕捉しないであろうが、非常に困難な目標の最小化結晶構造は、プロトコルを使用して、重要な機構的洞察を提供し得ることが想定されます。
単一または入力として、スナップショットの限られた数の基本モードの洞窟探検家19は 、標準のラップトップ上の非専門家が使用することができます。我々の経験3に基づいて、ボトルネックの半径トンネル( すなわち、半径最も狭い点で)よりも小さい1オングストロームは、結晶水の分子が予測トンネル中央の左側( 図1)内に存在する場合は特に、水のために非常に関連することができます。一方、大きなボトルネック半径が活性部位10の内と外基質の輸送のためのトンネルを意味可能性があります。補足コードファイル2のスクリプトは、予測トンネルの視覚化のために非専門家が使用することができます。今後の実験では、相同性モデルは、水のネットワークとダイナミクスの原子論的研究を可能にするために十分な高解像度になりますかどうかを明らかにします。活性部位に存在するリガンドととせずに、分子動力学シミュレーションを実行する方法に光を流し、トンネル識別のプロセスも重要であろう影響を与えます。
膜タンパク質の動力学は、手ごわい挑戦25を構成することができます 。プロトコルは、本明細書において、単純な膜抽出プロトコルに基づいていますこのような超遠心分離機のような高価な装置を使用せずに膜酵素を得ました。最終研磨工程としてのゲルろ過を使用することは、潜在的な残留膜の粒子を除去し、適切な界面活性剤の環境25を定義することができます。
プロトコルから再現性の運動の結果を達成するための重要な側面は、超音波による基質ストック溶液を乳化することです。反応緩衝液で希釈し、疎水性基板の簡単なボルテックスは、不均一な基板界面活性剤の混合物を与えます。非乳化基質溶液のピペッティングは、初速度の正確な決意を妨げる(定量GCにより確認)再現不可能な濃度をもたらします。これとは対照的に、適切に乳化ストック溶液のピペッティングは、0.98から0.99の範囲のR 2と初期速度の線形回帰分析をもたらすべきです。疎水性基材のもう一つの重要な側面は、見かけの基質の溶解度であります基板界面活性剤の混合物で利用可能。実際には、基準基板のスクアレンを有するトリテルペン酸シクラーゼを飽和させることはできませんでした。この理由のために見かけの k cat / K M値を結合し、化学の両方からの寄与を含んでいる可能性があり、本明細書に提示されています。しかし、化学物質は、トリテルペンシクラーゼ3によって行わpolycyclizationカスケードのための k cat / K Mのための律速であることが示されています。
これは、外部の温度計との反応のガラスバイアル内部の実際の温度を確認するために非常に重要です。それでも、線形フィットは、異なる温度で本質的な一定の見かけの k cat / K M値を有する変異体のために貧しいことができます。これは、ゼロに近い活性化エンタルピー( 図2Bおよび2C)と、本明細書S168F変異型( 図2A)のために強調されています。非常にSmaI見かけの k cat / K MにおけるLの温度依存性変化は、観察された活性化エントロピーΔS‡( すなわち、 図2Bの線形プロットでインターセプト)の不確実性を誘発する可能性があります。原理的には、観察された活性化エントロピーは、タンパク質濃度を測定することによって検出されない種々のバリアントの活性酵素の異なる存在量によって影響を受ける可能性があります。これは、ワンポットでいくつかの基材を混合したときに実験誤差が低減されることが予想されます。すべての異なる基板は、これらの状況下での酵素の同じ量(式4)と相互に作用するためです。抽出溶媒の使用は、内部標準を抽出および/またはGC注入の間の差異を考慮することが重要であるとスパイク。
遷移状態理論に成功酵素学26で使用されています。この重要な理論的枠組みは、もともとドでした気相中での単分子反応のためのveloped。しかし、酵素は、主に古典的な活性化エネルギー障壁26を下げることによって働くことが示されています。透過係数は1本明細書中では、測定活性化エンタルピーおよび/またはエントロピーに影響を与える可能性があると仮定します。トンネリングの寄与、及びそのような遷移状態のrecrossingなどの他の非古典的効果は、おおよそエネルギーの約4キロカロリー/モルに相当する触媒26に千倍に貢献することができます。これは、野生型酵素(328 K、 図2Cで16キロカロリー/モル)で表示された活性化エントロピーは、不均一な透過率に起因する、非古典的な効果よりもはるかに大きいことが分かります。プロトコルを使用して、野生型およびトンネルバリアントの活性化の熱力学的パラメータを比較した場合の透過係数の影響は減少するはずです。
活性化のギブスの自由エネルギー(ΔG‡)がコンポです( – T *ΔS‡)用語エンタルピー(ΔH‡)とエントロピーの両方のsed。触媒中の酵素では、溶媒再編成は、両方のパラメータに影響を与えることができます。現在のプロトコルが必要な生物物理学的実験フレームワークと関連し、in silicoでユーザーフレンドリーな計算ツールのツールボックスを組み立てることにより、これらの現象の研究を促進することが期待されます。この方法は、膜結合酵素による触媒反応を含む酵素プロセスの多数の研究に有用であることが想定されます。
The authors have nothing to disclose.
The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.
YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |