Livraison des protéines, des peptides ou imperméable aux cellules petites molécules dans des cellules vivantes par incubation avec le réactif dfTAT endosomolytique
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
Stratégies de prestation macromoléculaires utilisent généralement la voie d'endocytose comme une voie d'entrée cellulaire. Cependant, endosomal piégeage limite considérablement l'efficacité avec laquelle macromolécules pénétrer l'espace cytosolique des cellules. Récemment, nous avons contourné ce problème en identifiant le réactif dfTAT, un dimère de liaisons disulfure du peptide TAT de la tétraméthylrhodamine marqué avec un fluorophore. Nous avons généré un dimère marqué par fluorescence du peptide pénétrant dans les cellules (CPP) TAT prototypique, dfTAT, qui pénètre dans les cellules vivantes et atteint l'espace cytosolique des cellules avec une efficacité particulièrement élevée. Cytosolique de livraison dfTAT est réalisé dans plusieurs lignées cellulaires, y compris des cellules primaires. En outre, la livraison n'a pas d'incidence sensiblement la viabilité cellulaire, la prolifération ou l'expression génique. dfTAT peut délivrer de petites molécules, des peptides, des anticorps, des enzymes biologiquement actives et un facteur de transcription. Dans ce rapport, nous décrivons les protocoles impliqués dans DFTALa synthèse de T et la livraison cellulaire. Le manuscrit décrit comment contrôler la quantité de protéine délivrée à l'espace cytosolique des cellules en faisant varier la quantité de protéine administrée de manière extracellulaire. Enfin, les limites actuelles de cette nouvelle technologie et les étapes impliquées dans la validation de la livraison sont discutées. Les protocoles décrits doivent être extrêmement utile pour les dosages à base de cellules ainsi que pour la manipulation ex vivo et la reprogrammation de cellules.
Introduction
La livraison des protéines, des peptides ou de petites molécules cellulaires imperméable dans les cellules vivantes est souvent souhaitable dans de nombreuses applications biologiques ou biotechnologiques (imagerie cellulaire, des tests fonctionnels, reprogrammation cellulaire, etc.) 4.1. De nombreuses approches de livraison ont déjà été signalées, y compris une micro-injection, l'électroporation ou l'utilisation d'agents de support (par ex., Des peptides de pénétration cellulaire telles que des lipides, TAT) 5-7. Chaque technique a généralement avantages et les inconvénients spécifiques qui pourraient rendre ces approches adéquates pour certaines applications, mais pas pour d'autres. Questions courantes concernent l'efficacité de livraison pauvres et / ou le manque de contrôle de la quantité de matériel est livré 8,9, la toxicité ou délétère impact physiologique 10,11, le manque de contrôle temporel, la livraison dans quelques cellules, mais pas dans toute une population (par ex., microinjection) 12, et de conjugaison complexe chimique ou formulation régimes 11.
<p clas s = "jove_content"> Récemment, nous avons développé une stratégie de prestation roman qui contourne ces limitations. Cette stratégie repose sur un peptide appelé dfTAT (dimère de TAT fluorescent) 13. dfTAT est dérivé du peptide bien savoir cellule-pénétrant (RPC) TAT. dfTAT contient deux copies de disulfure lié TAT marqués avec le fluorophore tétraméthylrhodamine. Malgré leurs similitudes, TAT et dfTAT diffèrent de manière significative de l'activité. TAT est généralement internalisé dans les cellules par endocytose. Ce RPC reste cependant la plupart du temps emprisonné à l'intérieur des endosomes (ce qui généralement conduit à une distribution ponctuée du peptide dans les cellules lorsqu'elles sont examinées par microscopie à fluorescence). Comme TAT, dfTAT est efficacement endocytose par les cellules. Cependant, dfTAT ne reste pas coincé à l'intérieur des endosomes. Au lieu de cela, il assure la médiation de fuite de l'endosome d'une manière qui est extrêmement efficace. L'activité de endosomolytique dfTAT peut alors être exploitée pour fournir des macromolécules par un essai d'incubation simple. MÉNAGEMENT "> La compréhension actuelle du processus d'exécution est le suivant. dfTAT induit macropinocytose. En conséquence, les cellules incubées avec dfTAT prennent des protéines solubles, des peptides ou de petites molécules (molécules d'intérêt, MOI) présents dans les médias par le fluide en phase endocytose (voir figure 1). Les interactions entre dfTAT et MOI ne sont pas nécessaires dans la mesure où les deux entités de trafic en même temps à l'intérieur de la voie d'endocytose. Comme dfTAT atteint un certain seuil dans la lumière des organites d'endocytose, on exprime l'activité de fuite de l'endosome (les détails moléculaires restent à être pleinement caractérisé). Le contenu de la lumière des organites qui fuient, et donc la MOI, est alors libéré dans les cellules. Cette approche est donc très pratique car aucun conjugaison ou de formulation des programmes avec MOI sont nécessaires. En outre, parce dfTAT est pas directement la modification d'un MOI, il ne doit pas interférer avec la fonction IAM une fois que la délivrance intracellulaire est réalisée. En outre, la concentration dedfTAT utilisé livraison est indépendante de celle de MOI dans les médias. Par exemple, la concentration dfTAT peut être maintenue constante entre les différentes expériences pour garantir l'efficacité de fuite reproductibles endosomal. En revanche, la concentration de la MOI dans les médias peut être progressivement modifié pour atteindre des niveaux souhaités de MOI livré dans le cytosol.L'efficacité de fuite endosomal haute réalisé avec dfTAT est remarquablement inoffensifs pour la plupart des cellules testées à ce jour. Ceci est une surprise car organites d'endocytose sont composante importante des cellules et on pourrait penser que la fuite dramatique médiée par dfTAT serait accompagnée par des réponses cellulaires délétères. Pourtant, les cellules traitées prolifèrent à la même vitesse que les cellules non traitées et ne présentent pas de changements significatifs dans leur transcriptome. En outre, la livraison peut être répété en quelques minutes avec des rendements de livraison reproductibles, ce qui indique que les cellules peuvent soit tolérer ou récupérer du processus de livraison sans perdreleur capacité d'endocytose ou de fuite endosomal. Réponses cellulaires subtiles pourraient avoir lieu lors de la livraison dfTAT et les détails moléculaires de ce que ces réponses pourraient être restent à explorer. Pourtant, en alliant efficacité, commodité de protocoles, et l'absence de toxicité, cette approche de la livraison devrait se révéler immédiatement utile dans de nombreuses applications à base de cellules. Les protocoles présentés ici visent à rendre cette technologie accessible à la communauté de recherche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules utilisées pour la livraison dfTAT ne devrait pas être trop confluentes (> 90% de confluence) car cela pourrait affecter l'efficacité de la livraison. Les cellules devraient également être en bonne santé: les cellules mortes à la culture peuvent libérer des fragments apoptotiques avec laquelle dfTAT peut interagir (par exemple, l'ADN à partir de noyaux dégradées). Cela peut interférer avec l'efficacité de la livraison et de la qualité de l'imagerie. Les cellules doiv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
References
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
- Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
- Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
- Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
- Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
- Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
- Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
- Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
- Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
- Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
- Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).
