Доставка белки, пептиды или сотовых непроницаемый малых молекул в живых клетках при инкубации с эндосомолитического реагента dfTAT
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
Высокомолекулярные стратегии доставки, как правило, используют в качестве эндоцитотический путь маршрута сотовых запись. Тем не менее, эндосом захвата серьезно ограничивает эффективность, с которой макромолекулы проникают цитозольного пространство клеток. Недавно мы обойти эту проблему путем идентификации реагента dfTAT, дисульфидной связью димер пептида TAT меченого флуорофором с тетраметилродамин. Мы сформировали флуоресцентно меченного димера прототип сотового проникновения пептид (СРР) ТАТ, dfTAT, который проникает живые клетки и достигает цитозольную пространство клеток с особенно высокой эффективностью. Цитозольного доставка dfTAT достигается в нескольких клеточных линий, в том числе первичных клеток. Кроме того, доставка не заметно повлиять на жизнеспособность клеток, пролиферацию или экспрессию генов. dfTAT может доставить небольшие молекулы, пептиды, антитела, ферменты, биологически активные и транскрипционный фактор. В этом докладе мы описываем протоколы, участвующие в DFTAСинтез Т и клеточная доставки. В рукописи описано, как контролировать количество белка подаваемого в цитозоле клеток пространстве, изменяя количество белка вводят внеклеточно. Наконец, обсуждаются текущие ограничения этой новой технологии и этапов в проверке доставку. Описанные протоколы должны быть чрезвычайно полезны для клеточных анализов, а также для манипулирования экс виво и перепрограммирования клеток.
Introduction
Доставка белки, пептиды или клеточных непроницаемый малых молекул в живых клетках часто желательно во многих биологических или биотехнологических приложений (сотовой изображений, функциональные пробы, сотовые перепрограммирования, и т.д.). 1-4. Многие подходы доставки уже сообщалось, в том числе микроинъекции, электропорации или использования носителей агенты (например., Cell-проникающих пептидов, таких как ТАТ, липиды) 5-7. Каждый метод, как правило, имеет определенные плюсы и минусы, которые могли бы сделать эти подходы достаточно для некоторых приложений, но не для других. Общие вопросы включают плохие эффективность доставки и / или отсутствие контроля, сколько материал поставляется 8,9, токсичности или вредного физиологического воздействия 10,11, отсутствие временной контроль, доставка в несколько клеток, но не в целом населения (например., микроинъекции) 12, и сложный химический сопряжения или формулировка схемы 11.
<p clas S = "jove_content"> В последнее время мы разработали новую стратегию доставки, которая обходит эти ограничения. Эта стратегия опирается на пептида по имени dfTAT (димер люминесцентные ТАТ) 13. dfTAT происходит от хорошо знаю клеток проникающим пептида (СРР) ТАТ. dfTAT содержит две дисульфидные связаны копии ТАТ меченные флуорофора тетраметилродамин. Несмотря на сходство, ТАТ и dfTAT значительно отличаются деятельности. ТАТ обычно интернализации в клетки эндоцитоза. Это СРР, однако, остается в основном в ловушке внутри эндосом (это, как правило, приводит к распределению точечной пептида внутри клеток при рассмотрении с помощью флуоресцентной микроскопии). Как ТАТ, dfTAT эффективно эндоцитозу клетками. Тем не менее, dfTAT не оставаться в ловушке внутри эндосом. Вместо этого, он опосредует утечки эндосом таким образом, что является чрезвычайно эффективным. Эндосомолитического деятельность dfTAT то может быть использована для доставки макромолекул с помощью простого анализа инкубации. ntent "> В настоящее время понимание процесса доставки выглядит следующим образом. dfTAT вызывает макропиноцитозом. В результате, клетки инкубировали с dfTAT занять растворимые белки, пептиды, или небольших молекул (молекул интересов, МВД), присутствующих в средствах массовой информации по жидкости фазы эндоцитоз (рисунок 1). Взаимодействие между dfTAT и МВД не нужны, пока обе структуры трафика вместе в эндоцитотического пути. Как dfTAT достигает определенного порога в пределах просвет эндоцитотических органелл, он выражает свою деятельность утечки эндосом (молекулярные данные остаются полностью охарактеризованы). Содержание просвет негерметичных органелл, и, следовательно, МВД, затем выбрасывается в клетках. Этот подход, следовательно, очень удобно, так как отпадает необходимость в схемах сопряжения или композиции с MOI. Кроме того, из-за dfTAT является непосредственно не модификации MOI, следует также не мешают функции MÕIS раз внутриклеточной доставки достигается. Кроме того, концентрациюdfTAT используется доставки независимым от МВД в средствах массовой информации. Например, концентрация dfTAT может поддерживаться постоянным между различными экспериментами, чтобы гарантировать воспроизводимость эффективность в утечки эндосомный. В противоположность этому, концентрация МВД в среде может быть постепенно изменяется для достижения желаемых уровней МВД поставляется в цитозоле.Высокая эффективность эндосом утечки достигается с dfTAT удивительно безвредны для многих клеток, протестированных на сегодняшний день. Это потому, что сюрприз эндоцитотический органеллы важным компонентом клеток и можно было бы ожидать, что резкое утечки посредничестве dfTAT будет сопровождаться вредных клеточных реакций. Тем не менее, обработанные клетки размножаются с такой же скоростью, как необработанных клетках и не отображать любые существенные изменения в их транскриптома. Кроме того, доставка может быть повторен в течение нескольких минут с эффективностью доставки воспроизводимых, указывая, что клетки могут либо терпеть или восстановить из процесса доставки без потериих способность к эндоцитоза или утечки эндосомный. Тонкие клеточные ответы могут иметь место во время dfTAT доставки и молекулярных деталях, что эти ответы могут быть еще предстоит исследовать. Тем не менее, комбинируя высокую эффективность, удобство протоколов, а также отсутствие токсичности, эта поставка подход должен доказать сразу полезна во многих приложениях на основе клеток. Протоколы, представленные здесь, направлены на то, что эта технология доступна для научного сообщества.
Protocol
Representative Results
Discussion
Клетки, используемые для доставки dfTAT не должны быть чрезмерно сливной (> 90% слияния), так как это может повлиять на эффективность доставки. Клетки также должна быть здоровой: мертвые клетки в культуре могут освободить апоптоза фрагменты, с которыми могут взаимодействовать dfTAT (напри?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
References
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
- Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
- Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
- Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
- Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
- Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
- Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
- Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
- Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
- Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
- Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).
