La entrega de proteínas, péptidos o impermeable a las células pequeñas moléculas en células vivas por incubación con el reactivo endosomolítico dfTAT
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
Estrategias de prestación macromoleculares normalmente utilizan la vía endocítica como una vía de entrada celular. Sin embargo, el atrapamiento endosomal limita severamente la eficiencia con la que las macromoléculas penetrar en el espacio citosólico de células. Recientemente, hemos eludido este problema mediante la identificación del reactivo dfTAT, un dímero enlace disulfuro del péptido TAT etiquetado con la tetrametilrodamina fluoróforo. Hemos generado un dímero marcado con fluorescencia del péptido de penetración celular (CPP) TAT prototípico, dfTAT, que penetra en las células vivas y alcanza el espacio citosólico de células con una eficiencia particularmente alta. La entrega citosólica de dfTAT se logra en varias líneas celulares, incluyendo células primarias. Por otra parte, la entrega no afecta notablemente la viabilidad celular, la proliferación o la expresión génica. dfTAT puede entregar moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, enzimas biológicamente activa y un factor de transcripción. En este informe se describen los protocolos involucrados en DFTASíntesis de T y la entrega celular. El manuscrito describe cómo controlar la cantidad de proteína entregada al espacio citosólico de las células mediante la variación de la cantidad de proteína administrada extracelularmente. Finalmente, se discuten las limitaciones actuales de esta nueva tecnología y pasos involucrados en la validación de la entrega. Los protocolos descritos deben ser extremadamente útil para ensayos basados en células, así como para la manipulación ex vivo y la reprogramación de las células.
Introduction
La entrega de proteínas, péptidos o pequeñas moléculas impermeables a las células en células vivas es a menudo deseable en muchas aplicaciones biológicas o biotecnológicas (de imagen celular, ensayos funcionales, la reprogramación celular, etc.) A 1-4. Ya se han reportado muchos enfoques de entrega, incluyendo la microinyección, electroporación, o el uso de agentes de portador (por ejemplo., Péptidos penetran en las células, tales como TAT, lípidos) 5-7. Cada técnica tiene normalmente ventajas y desventajas específicas que podrían hacer que estos enfoques adecuados para ciertas aplicaciones, pero no para otros. Problemas comunes incluyen la eficiencia de entrega de pobres y / o la falta de control de la cantidad de material que se entrega 8,9, toxicidad o efectos fisiológicos deletéreos 10,11, la falta de control temporal, entrega en pocas células, pero no en toda una población (por ejemplo., microinyección) 12, y la conjugación química compleja o de formulación de planes de 11.
<p clas s = "jove_content"> Recientemente, hemos desarrollado una estrategia de entrega novela que evita estas limitaciones. Esta estrategia se basa en un péptido llamado dfTAT (dímero TAT fluorescente) 13. dfTAT se deriva a partir del péptido de penetración celular bien conocido (CPP) TAT. dfTAT contiene dos copias disulfuro unido de TAT etiquetados con el tetrametilrodamina fluoróforo. A pesar de sus similitudes, TAT y dfTAT difieren significativamente en la actividad. TAT típicamente se internaliza en las células por endocitosis. Sin embargo, esto CPP permanece atrapado en su mayoría dentro de los endosomas (esto por lo general conduce a una distribución puntiforme del péptido dentro de las células cuando se examina por microscopía de fluorescencia). Como TAT, dfTAT se endocitosis eficientemente por las células. Sin embargo, dfTAT no se queda atrapado dentro de endosomas. En su lugar, media la fuga de endosomal de una manera que es extremadamente eficiente. La actividad endosomolítica de dfTAT puede entonces ser explotado para entregar macromoléculas mediante un ensayo de incubación simple. ntent "> La comprensión actual del proceso de entrega es como sigue. dfTAT induce macropinocytosis. Como resultado, las células incubadas con dfTAT ocupan proteínas solubles, péptidos, o pequeñas moléculas (moléculas de interés, MOI) presentes en los medios de comunicación por el fluido de fase endocitosis (ver Figura 1). Las interacciones entre dfTAT y MOI no son necesarios, siempre y cuando tanto el tráfico entidades juntos dentro de la vía endocítica. Como dfTAT alcanza un cierto umbral dentro de la luz de los orgánulos endocíticas, expresa su actividad fuga de endosomal (los detalles moleculares siendo para ser totalmente caracterizado). El contenido del lumen de los orgánulos que gotean, y por lo tanto la MOI, se libera en las células. Por tanto, este enfoque es muy conveniente, ya que no se requieren de conjugación o formulación esquemas con MOI. Además, debido a dfTAT es no modificar directamente una MOI, también no debe interferir con la función de las MOI una vez que se consigue el suministro intracelular. Además, la concentración dedfTAT utiliza entrega es independiente de la de MOI en medios de comunicación. Por ejemplo, la concentración dfTAT puede mantenerse constante entre los diferentes experimentos para garantizar la eficiencia reproducibles en fugas endosomal. En contraste, la concentración de MOI en los medios se puede cambiar gradualmente para lograr los niveles deseados de MOI entregado en el citosol.La alta eficacia de fuga endosomal logrado con dfTAT es notablemente inocuos para muchas de las células ensayadas hasta la fecha. Esto es una sorpresa porque orgánulos endocíticas son componente importante de las células y uno esperaría que la fuga dramática mediada por dfTAT iría acompañado de las respuestas celulares deletéreos. Sin embargo, las células tratadas proliferan a la misma velocidad que las células no tratadas y no muestran cambios significativos en su transcriptoma. Por otra parte, la entrega se puede repetir dentro de minutos con eficiencias de entrega reproducibles, lo que indica que las células pueden o bien tolerar o recuperarse de el proceso de entrega sin perdersu capacidad para la endocitosis o fugas endosomal. Respuestas celulares sutiles pueden tener lugar durante el parto dfTAT y los detalles moleculares de lo que podrían ser permanecen estas respuestas para ser explorado. Sin embargo, mediante la combinación de alta eficiencia, conveniencia de protocolos, y la falta de toxicidad, este enfoque entrega debe demostrar inmediatamente útil en muchas aplicaciones basadas en células. Los protocolos presentados en este documento están dirigidas a hacer esta tecnología al alcance de la comunidad científica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células utilizadas para la entrega dfTAT no debe ser demasiado confluentes (> 90% de confluencia), ya que esto podría afectar a la eficiencia en la entrega. Las células también deben ser saludables: las células muertas en el cultivo pueden liberar fragmentos apoptóticos con la que dfTAT puede interactuar (por ejemplo, el ADN de núcleos degradados). Esto a su vez puede interferir con la eficacia del suministro y la calidad de la imagen. Las células se deben lavar a fondo para eliminar FBS antes de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
References
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