Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
Makromoleküler teslim stratejileri genellikle hücresel bir giriş yolu olarak endositik yolu kullanmaktadır. Ancak, endozomal tuzak ciddi hücrelerin sitozolik alan nüfuz makromoleküller hangi ile verimliliği sınırlar. Son zamanlarda, biz reaktif dfTAT, fluorofor tetrametilrodamin etiketli peptid TAT bir disülfit bağ dimer belirleyerek bu sorunu hile var. Bu, canlı hücreleri nüfuz eder ve özellikle yüksek bir verimlilik ile hücrelerin sitosolik alan ulaşır prototip hücre nüfuz peptid (CPP) TAT, dfTAT, bir floresan etiketli dimer yarattı. DfTAT bölgesinin Sitosolik dağıtım birincil hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre çizgileri elde edilir. Ayrıca, dağıtım belirgin hücre canlılığı, proliferasyonu veya gen ekspresyonunu etkilememektedir. dfTAT küçük moleküller, peptitler, antikorlar, enzimler ve biyolojik olarak aktif bir transkripsiyon faktörünü sağlayabilir. Bu raporda, dfTA katılan protokol tarifT sentezi ve hücresel teslimat. Eser hücre dışı İlaç olarak verilen proteinin miktarının değiştirilmesiyle hücre sitosolik alan teslim proteinin miktarının kontrolü açıklamaktadır. Son olarak, bu yeni teknoloji ve teslimat doğrulayarak katılan adımların güncel sınırlamalar tartışılmıştır. Tarif edilen protokoller, hücre bazlı deneyler hem de hücrelerinin ex vivo, manipülasyon ve yeniden programlama için çok yararlı olacaktır.
Introduction
Canlı hücrelere proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük molekül iletilmesi pek çok biyolojik veya biyoteknolojik uygulamalar (hücresel görüntüleme işlevsel deneyler, hücre yeniden programlama, vb.) 1-4 genellikle arzu edilen bir durumdur. Birçok dağıtım yaklaşımlar önce mikroenjeksiyon, elektroporasyon veya taşıyıcı maddelerin kullanımı da dahil olmak üzere, rapor edilmiştir (örn., Örneğin TAT hücre nüfuz peptidler, lipidler) 5-7. Her teknik genellikle belirli uygulamalar için değil, başkaları için bu yaklaşımlar yeterli hale getirebileceğini belirli artıları ve eksileri vardır. Sık karşılaşılan sorunlar birkaç hücrelerde değil bütün bir halkın ve / veya eksikliği 8,9 teslim edilir ne kadar malzeme kontrolü, toksisite veya zararlı fizyolojik etkisi 10,11, zamansal kontrol eksikliği, teslimat kötü teslimat verimliliği (dahil örn., mikroenjeksiyon) 12 ve karmaşık kimyasal çekimi veya formülasyon şemaları 11.
<p clas s = "jove_content"> Son zamanlarda, biz bu sınırlamaları ortadan bir roman teslim strateji geliştirdik. Bu strateji dfTAT adında bir peptid (dimer floresan TAT) 13 dayanır. dfTAT iyi bilinen hücre nüfuz peptid (CPP) TAT türetilmiştir. dfTAT fluorofor tetrametilrodamin ile etiketlenmiş TAT iki disülfür bağlı bir kopyasını içerir. Onların benzerliklere rağmen, TAT ve dfTAT aktivitesinde önemli ölçüde farklıdır. TAT tipik endositoz ile hücre içine yerleştirilebilir. Bu CPP Ancak çoğunlukla (floresan mikroskobu ile incelendiğinde bu genellikle hücrelerin içinde peptid bir noktalı dağılımına yol) endozomlardan içinde sıkışıp kalır. TAT gibi, dfTAT verimli hücreler tarafından endocytosed edilir. Ancak, dfTAT endozomlardan içinde sıkışıp kalmıyor. Bunun yerine, son derece verimli bir şekilde endozomal sızıntı aracılık eder. DfTAT ve endosomolitik aktivitesi daha sonra basit bir kuluçka testi ile makromoleküllerin teslim için kullanılabilir. şöyle ntent "> dağıtım işleminin mevcut anlayış. dfTAT makropinositoz neden olur. Sonuç olarak, dfTAT kuluçkaya hücreler sıvı faz ortam içinde mevcut olan çözünür protein, peptid, veya küçük molekülleri (ilgili moleküller, MOI) sürebilir endositoz (Şekil 1). dfTAT ve İçişleri arasındaki etkileşimler birlikte endositik yolunun içinde hem de kurumlar trafik sürece gerekli değildir. dfTAT endositik organellerin lümeni içinde belirli bir eşiğe ulaştığında, onun endozomal kaçak aktivitesini (moleküler ayrıntıları ifade dfTAT, çünkü bu yaklaşım Ayrıca. Bu nedenle MOI konjugasyon veya formülasyon düzenleri gerekli olduğu gibi çok uygundur.). tam olarak karakterize olması sızıntılı organellerin lümenin içeriğini kalır ve bu nedenle, İB, daha sonra hücrelerden salınan hücre içi taşıyıcı ulaşıldıktan sonra doğrudan MOI değiştirerek değil, aynı zamanda MOIS işlevine müdahale etmemelidir. Buna ek olarak, konsantrasyondfTAT dağıtım medyada MOI bu bağımsız kullanılır. Örneğin, dfTAT konsantrasyonu endozomal kaçağı tekrarlanabilir verim sağlamak için farklı deneyler arasında sabit tutulabilir. Bunun aksine, ortam içinde MOI konsantrasyonu giderek MOI sitozol içinde teslim istenen seviyelerinin elde edilmesi için değiştirilebilir.DfTAT ile elde yüksek endozomal kaçak verimliliği bugüne kadar test edilen hücrelerin birçok dikkat çekici zararsız olduğunu. Endositik organelleri hücre önemli bir bileşenidir ve bir dfTAT aracılık dramatik kaçak zararlı hücresel yanıtları eşlik edeceğini beklenir, çünkü bu bir sürpriz oldu. Bununla birlikte, tedavi edilen hücreler, tedavi edilmemiş hücrelere aynı hızda çoğalır ve transcriptome önemli bir değişiklik göstermez. Ayrıca, dağıtım hücreleri kaybetmeden teslim sürecinden tahammül ya kurtarabilirsiniz ya belirten tekrarlanabilir dağıtım verimliliği ile birkaç dakika içinde tekrar edilebilirendositoz veya endozomal sızıntı onların kapasitesi. Ince hücresel yanıtları dfTAT teslimat ve bu yanıtların keşfedilmeyi beklemektedir ne olabileceğini moleküler ayrıntıları sırasında yer alabilir. Ancak, yüksek verim, protokollerin kolaylık ve toksisite eksikliği birleştirerek, bu teslim yaklaşımı birçok hücre tabanlı uygulamalarda hemen kullanışlı ispatlamak zorundadır. Burada sunulan protokolleri araştırma topluluğuna bu teknoloji erişilebilir hale getirmeyi amaçlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çünkü bu aşırı konfluent olmamalıdır dfTAT teslimat için kullanılan hücreler (>% 90 konflüans) verme etkinliğini etkileyebilir. Hücreler de sağlıklı olması gerekir: kültürdeki ölü hücreler dfTAT (bozulmuş çekirdekten örneğin DNA) etkileşim hangi ile apoptotik parçaları serbest bırakabilirsiniz. Bu da bu uygulama randımanına ve görüntüleme kalitesini engelleyebilir. Hücreler dfTAT eklemeden önce FBS kaldırmak için iyice yıkanmalıdır. FBS içinde BSA bulunan dfTAT ba?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
References
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
- Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
- Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
- Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
- Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
- Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
- Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
- Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
- Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
- Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
- Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).
