交货蛋白质，多肽或细胞不可渗透的小分子进入活细胞被孵化与核内体溶解试剂dfTAT
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
大分子递送策略通常利用内吞途径蜂窝条目的路由。然而，内体截留严重限制与大分子穿透细胞的胞质空间的效率。最近，我们通过确定试剂dfTAT，标记有荧光团四甲肽TAT的二硫键二聚体规避这个问题。我们已经生成原型细胞穿透肽（CPP）的TAT，dfTAT，穿透活细胞和到达细胞具有特别高的效率的胞质空间的荧光标记的二聚体。胞质递送dfTAT的是在多种细胞系，包括原代细胞来实现的。此外，交货不会明显影响细胞的活力，增殖或基因表达。 dfTAT可以提供小分子，肽，抗体，生物活性酶和转录因子。在这份报告中，我们描述参与DFTA协议T合成和细胞输送。手稿描述如何通过改变蛋白质的细胞外给药量以控制蛋白质递送至细胞的胞质空间的量。最后，这种新技术和涉及验证输送步骤的当前局限性进行了讨论。所描述的方案应为基于细胞的测定以及对于离体操作的细胞和重编程是非常有用的。
Introduction
递送蛋白质，肽或细胞不可渗透的小分子进入活细胞是在许多生物或生物技术应用（细胞成像，功能测定法，细胞重新编程等 ）1-4常常合乎需要的。许多递送方法已被报道，包括显微注射，电穿孔，或用载体试剂（例如，细胞穿透肽，例如TAT，脂质）5-7。每种技术一般都有特定的优点和缺点，可能使这些方法足以满足一定的应用，但不是为别人。常见问题涉及在少数细胞而不在整个贫困人口递送效率和/或控制的多少材料输送8,9，毒性或有害生理影响10,11，缺乏临时控制的，交付的缺乏（例如，显微注射）12，和复杂的化学缀合或制剂方案11。
<p clas S =“jove_content”>最近，我们已经开发了一种新的交付策略绕开这些限制。这一战略依赖于一个名为dfTAT肽（二聚体荧光TAT）13。 dfTAT从公知的细胞穿透肽（CPP）的TAT而得。 dfTAT包含TAT的两个二硫键结合拷贝标记荧光团四甲基罗丹明。尽管他们的相似之处，TAT和dfTAT活性显著不同。 TAT是典型的内吞作用内化进入细胞。这CPP仍然但是在大多数被困在内涵体（这通常会导致细胞内的肽的点状分布时，利用荧光显微镜检查）。像TAT，dfTAT有效地被细胞内吞。然而，dfTAT不会留在里面内涵体困。相反，它介导内体泄漏的方式，是非常有效的。 dfTAT的内体裂解活性可以然后被利用通过一个简单孵育测定递送大分子。 ntent“>传送过程的当前理解如下。dfTAT诱导巨吞。其结果是，细胞孵育dfTAT占用的可溶性蛋白，肽或小分子（感兴趣的分子，MOI）存在于介质通过流体相内吞作用（ 参见图1）。dfTAT和MOI之间的相互作用不是必须的，只要内吞途径中一起两个实体通信。正如dfTAT到达内吞细胞器的内腔中一个特定的阈值，它表示它的内体泄漏活性（的分子细节仍有待充分表征的）。漏细胞器的内腔的内容，因此，教学语言，然后被释放到细胞中。因此，这种方法是与MOI没有缀合或制剂计划必须很方便的。此外，由于dfTAT是不直接修改一个MOI，它还应不同的MOI功能干扰一旦细胞内递送的实现。此外，浓度dfTAT用于交付是独立于MOI的媒体。例如，dfTAT浓度可以保持不同的实验之间保持恒定，以保证在内体泄漏重现的效率。与此相反，MOI在媒体浓度可逐渐改变以达到所需水平的细胞质MOI交付。实现了与dfTAT高内体泄漏效率显着地无害的许多测试日期的细胞。这是一个惊喜，因为内吞细胞器是细胞的重要组成部分，人们所期望的显着泄漏通过dfTAT介会伴随着有害的细胞反应。然而，处理的细胞增殖以相同的速率作为未经处理的细胞，并且不显示在其转录任何显著改变。此外，可交付使用可重复的递送效率分钟内反复，这表明细胞可以容忍或恢复从分娩过程，而不会丢失他们的能力，内吞作用或内体泄漏。 dfTAT交付和什么这些反应可能是有待探索的分子细节中微妙的细胞反应可能发生。然而，通过结合高效率，便利性的协议，并没有毒性，这种交付方法应该证明在许多细胞为基础的应用可以立即投入使用。本文提出的协议的目的是使该技术访问研究界。
Protocol
Representative Results
Discussion
因为这用于dfTAT交付不应过分融合的细胞（> 90％汇合）可能会影响传递效率。该细胞也应该是健康的：死细胞的培养可以释放凋亡片段与dfTAT可交互（例如，从DNA降解核）。这反过来又可以与递送效率和成像质量干扰。细胞应彻底洗净加入dfTAT之前删除FBS。 BSA存在的FBS可以结合dfTAT并且这可以降低dfTAT的递送效率。洗涤然而，应当小心以过大的力进行可能导致贴壁细胞从培养皿分离?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
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