Leverans av proteiner, peptider eller cellimpermeabel Små molekyler i levande celler genom inkubation med Endosomolytic Reagens dfTAT
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
Makromolekylära leveransstrategier utnyttjar typiskt endocytiska vägen som en väg av cellulär inträde. Men endosomala inneslutning begränsar allvarligt effektiviteten med vilken makromolekyler penetrera cytosoliska utrymmet av celler. Nyligen har vi kringgås detta problem genom att identifiera reagenset dfTAT, en disulfidbindning dimer av peptiden TAT märkt med fluorofor tetrametylrodamin. Vi har genererat en fluorescensmärkt dimer av den prototypiska cellpenetrerande peptid (CPP) TAT dfTAT, som tränger levande celler och når den cytosoliska rymden av celler med en särskilt hög verkningsgrad. Cytosoliskt leverans av dfTAT uppnås på flera cellinjer, inklusive primärceller. Dessutom är leverans inte märkbart påverka cellviabilitet, spridning eller genuttryck. dfTAT kan leverera små molekyler, peptider, antikroppar, biologiskt aktiva enzymer och en transkriptionsfaktor. I denna rapport beskriver vi de protokoll som är involverade i dfTAT-syntes och cellulär leverans. Handskriften beskriver hur man styr den mängd protein som levereras till den cytosoliska utrymmet av celler genom att variera mängden av protein som administreras extracellulärt. Slutligen de nuvarande begränsningarna av den nya tekniken och stegen i att validera leverans diskuteras. De beskrivna protokoll bör vara mycket användbart för cellbaserade analyser samt för ex vivo manipulation och omprogrammering av celler.
Introduction
Leveransen av proteiner, peptider eller celltäta små molekyler i levande celler är ofta önskvärt i många biologiska eller biotekniska tillämpningar (cellulär imaging, funktionella analyser, cellulär omprogrammering, osv.) 1-4. Många frisättningsmetoder har redan rapporterats, inklusive mikroinjektion, elektroporering, eller användning av bärare medel (t ex., Cellpenetrerande peptider såsom TAT, lipider) 5-7. Varje teknik har typiskt specifika fördelar och nackdelar som kan göra dessa metoder tillräckligt för vissa tillämpningar, men inte för andra. Vanliga problem innebär dålig leverans effektivitet och / eller brist på kontroll över hur mycket material levereras 8,9, toxicitet eller skadlig fysiologisk effekt 10,11, brist på tidskontroll, leverans i några celler, men inte i en hel befolkning (t.ex.., mikroinjektion) 12, och komplex kemisk konjugering eller formuleringssystem 11.
<p clas s = "jove_content"> Nyligen har vi utvecklat ett nytt leveransstrategi som kringgår dessa begränsningar. Denna strategi bygger på en peptid som heter dfTAT (dimer fluorescerande TAT) 13. dfTAT härleds från välkända cellpenetrerande peptid (CPP) TAT. dfTAT innehåller två disulfidbundna kopior av TAT märkta med fluoroforen tetrametylrodamin. Trots deras likheter, TAT och dfTAT skiljer sig avsevärt i aktivitet. TAT är typiskt internaliseras i celler genom endocytos. Detta CPP förblir dock mestadels instängd endosomer (detta brukar leda till en punktformig fördelning av peptiden inuti celler vid undersökning av fluorescensmikroskopi). Liksom TAT är dfTAT effektivt endocytoseras av cellerna. Däremot dfTAT inte hålla instängd endosomer. Istället förmedlar det endosomala läckage på ett sätt som är extremt effektiv. Den endosomolytic aktivitet dfTAT kan sedan utnyttjas för att leverera makromolekyler genom en enkel inkubation analys. ntent "> Den nuvarande förståelsen av leveransprocessen är som följer. dfTAT inducerar macropinocytosis. Som ett resultat av celler inkuberade med dfTAT ta upp lösliga proteiner, peptider eller små molekyler (molekyler av intresse, MOI) som föreligger i media genom fluid fas endocytos (se figur 1). Interaktioner mellan dfTAT och MOI är inte nödvändigt så länge båda enheterna trafik tillsammans inom endocytiska vägen. Som dfTAT når en viss tröskel inom lumen endocytic organ, uttrycker den sin endosomal läckage aktivitet (de molekylära detaljerna återstår att vara fullt karakteriserad). Innehållet i lumen av läckande organeller, och därför MOI, släpps sedan in i cellerna. Denna metod är därför mycket bekväm eftersom inga konjugering eller formuleringssystem med MOI krävs. Dessutom, på grund dfTAT är inte direkt modifiera en MOI, bör det inte heller störa MOIs funktion när intracellulär leverans uppnås. Dessutom koncentrationen avdfTAT används leverans är oberoende av MOI i media. Exempelvis kan dfTAT koncentration hållas konstant mellan olika experiment för att garantera reproducerbara effektivisera endosomal läckage. Däremot kan koncentrationen av MOI i media gradvis ändras för att uppnå önskade nivåer av MOI levereras i cytosolen.Den höga endosomala läckage effektivitet uppnås med dfTAT är anmärkningsvärt oskadlig för många av de testade hittills celler. Detta är en överraskning eftersom endocytic organ är viktig del av cellerna och man skulle förvänta sig att den dramatiska läckage förmedlas av dfTAT skulle åtföljas av skadliga cellulära svar. Ändå behandlade cellerna föröka sig i samma takt som obehandlade celler och visar inte några väsentliga förändringar i deras transkriptom. Dessutom kan leverans upprepas inom några minuter med reproducerbara leverans effektivitet, vilket tyder på att celler kan antingen tolererar eller återhämta sig från leveransprocessen utan att förloraderas förmåga till endocytos eller endosomal läckage. Subtila cellulära svar kan ske under dfTAT leverans och de molekylära detaljerna i vad dessa svar skulle kunna återstår att utforskas. Men genom att kombinera hög effektivitet, bekvämlighet protokoll, och brist på toxicitet, bör denna leverans tillvägagångssätt vara omedelbart användbar i många cell-baserade applikationer. De protokoll som presenteras här syftar till att göra denna teknik tillgänglig för forskarsamhället.
Protocol
Representative Results
Discussion
De celler som används för dfTAT leverans bör inte vara alltför sammanflytande (> 90% konfluens) eftersom detta kan påverka leveranseffektiviteten. Cellerna bör också vara friska: döda celler i kulturen kan frisätta apoptotiska fragment med vilka dfTAT kan interagera (t.ex., DNA från nedbrutna kärnor). Detta i sin tur kan interferera med leveranseffektiviteten och kvaliteten på avbildning. Celler bör tvättas noggrant för att avlägsna FBS innan du lägger dfTAT. BSA närvarande i FBS kan binda …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
References
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
- Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
- Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
- Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
- Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
- Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
- Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
- Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
- Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
- Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
- Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).
