Stabil og effektiv genetisk modificering af celler i Voksen Mouse V-SVZ til analyse af neural stamcelle selvstyrende og ikke-selvstændige effekter

Summary

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Abstract

Relativt hvilende somatiske stamceller understøtter livslang cellefornyelsen i de fleste voksne væv. Neurale stamceller i den voksne pattedyrs hjerne er begrænset til to specifikke neurogene nicher: den subgranular zone af gyrus dentatus i hippocampus og den ventrikulære-subventrikulære zone (V-SVZ, også kaldet subependymal zone eller SEZ) i væggene af den laterale ventrikler. Udviklingen af in vivo transfer strategier for voksne stamcellepopulationer gen (dvs. dem i pattedyrs hjerne), hvilket resulterer i langvarig ekspression af ønskede transgener i stamceller og deres afledte afkom er et afgørende redskab i løbende biomedicinsk og bioteknologisk forskning. Her er en direkte in vivo metode præsenteret for den stabile genetiske modifikation af voksne mus V-SVZ celler, der drager fordel af cellecyklus-uafhængig infektion med LVs og den højt specialiserede cytoarchitecture af V-SVZ'en niche. Konkret den nuværende protokol involverers injektion af tomme LV'er (kontrol) eller LV'er koder specifikt transgen ekspressionskassetter ind i enten V-SVZ selv, til in vivo målretning af alle typer af celler i niche, eller ind i de laterale ventrikel lumen, for målretning af ependymale kun celler. Ekspressionskassetter derefter integreret i genomet af de transducerede celler og fluorescerende proteiner, også kodes af LVS, mulighed for påvisning af de transducerede celler til analyse af celle- autonome og ikke-autonome, niche-afhængige effekter i de mærkede celler og deres afkom.

Introduction

Den murine ventrikulære-subventrikulære zone (V-SVZ), i væggene i den laterale ventrikel vender striatum, er en meget aktiv germinal region, hvor en kontinuerlig proces af progenitorcelle replikations- og differentiering påfører den vedvarende produktion af lugtekolben (OB ) interneuroner og corpus callosum oligodendrocytter ^1. Livslang generation af disse celler synes at blive understøttet af tilstedeværelsen i denne region af neurale stamceller (NSC; også kaldet B1 celler), der udtrykker den astrocytiske antigen glial fibrillært surt protein (GFAP) og stamceller markører, såsom nestin, Id1 og Sox2 ^2. GFAP-udtrykkende B1 celler genererer transit forstærke stamfader (TAP) celler (C-celler), som udtrykker transskription faktorer Dlx2 (distal-mindre homeobox 2) og Ascl1 (pattedyr achaete-schute homolog 1), og deler sig hurtigt et par gange, før de giver anledning til migrerende neuroblaster (A celler) eller oligodendroblasts ^3. Newly-genereret spredningsrelateredebejdsaktiviteter neuroblaster migrere anteriort, danner rostralt vandrende strøm (RMS) til OB, hvor de integreres i det granulerede og glomerulære lag som differentierede hæmmende interneuroner. Migrering unge oligodendroblasts flytte til CC, hvor de bliver umodne NG2-positive celler, der fortsat at dele lokalt eller differentiere til modne myelinerende oligodendrocytter ^1,4.

B1 celler, som er afledt af føtale radiale glialceller, fastholde den langstrakte og polariseret morfologi deres forgængere og udviser en højt specialiseret forhold til deres niche. De spænder mellem ependym som linjer op ventriklen og netværket af blodkar, der overrisle V-SVZ'en niche. Den lille apikale proces af B1 celler interkalerer blandt multiciliated ependymocytes og ender i en enkelt ikke-motile primær cilium, mens deres basale proces udvider lange afstande for at nærme sig den plane vaskulære plexus, der vander denne niche slutning ibasal lamina af plexus kapillærer ^2,5-8.

Den mest pålidelige måde at skelne B1-NSC'er fra ikke-neurogene astrocytter, som også GFAP ^+, i det intakte V-SVZ niche er baseret på hel-mount præparater af ventriklen sidevæg og analysen af 3-D konfokal mikroskopi efter immunfarvning for GFAP at mærke den tynde B1-NSC apikal proces, β-catenin at afgrænse cellemembraner, og enten γ-tubulin som en markør for cilial basale organer eller acetyleret α-tubulin at mærke udstrækningen af de cilium ^5,8. Observationer af disse hel-mounts fra den ventrikulære overflade har angivet, at B1 og ependymceller er arrangeret i "vejrhaner" ^5, hvor uniciliated apikale processer i en eller flere GFAP ⁺ B1 celler omgivet af en roset af multiciliated ependymceller.

Den karakteristiske morfologi af B1 celler korrelerer med eksperimentelle bevismateriale indicating at blodkar / endotelceller og ventrikulær cerebrospinalvæske (CSF) udgør regulerede kilder af opløselige signaler virker på NSC'er ^2,6,9-11. På den ventrikulære overflade, homotypisk og heterotypiske apico-lateral interaktioner, der involverer ependymale og B1 celler indbefatter tight junctions og adherensovergange ^5,12. Endvidere adhæsionsmolekyler impliceret i de forbindelsesepitoper komplekser mellem B1 og ependymceller, såsom N-cadherin og V-CAM, er blevet vist at regulere ikke alene stærkt organiseret positionering af B1 i V-SVZ niche, men også deres hviletilstand ^{12 , 13.} Den ependymale-B1 cellemonolaget synes at fungere som en diffusionsbarriere tillader den regulerede strøm af vand og små molekyler fra CSF, men begrænser intercellulære passage af store proteiner ^10,11. Eksperimentelle data viser, at en unik position B1 celle apikale cilium kunne spille en rolle som en sensor af signalering polypeptider til stede i CSF ^2,5-7. Ependymceller er i sig selv også en kilde til opløselige og membranbundne signaler med en rolle i reguleringen af NSC adfærd ^14,15.

Sporbare nukleosider, såsom brom-deoxyuridin (BrdU) eller retrovira er ofte blevet brugt til at mærke progenitorceller, herunder NSC'er, in vivo. Disse fremgangsmåder er imidlertid ikke optimal for langsigtet skæbne opsporing, fordi BrdU signaler fortyndes ved gentagne celledelinger og retrovirus synes fortrinsvis at målrette transient amplifikation celler på grund af deres krav af celleproliferation til transduktion ^16,17. For at undersøge NSC fysiologi in vivo, herunder samspil med niche komponenter, er det afgørende at etablere en metode til at mærke og spore sjældent delende celler, som B1-NSC er stort set inaktiv og deres tilgrænsende ependymceller aldrig dele under fysiologiske betingelser ^3. Her viser vi, at lentivirusvektorer (LVs) giver mulighed for højeffektiv gen-mærketing og langsigtet ændring af voksne NSC'er og ikke-delende ependymceller grund mest rimeligt at deres evne til at transducere og integrere i genomet af target celler i en cellecyklus-uafhængig måde. Desuden viser vi, hvordan ruten for levering og viral titer hjælp til specifikt transducere ependymceller, men ikke B1 celler hvorved analysen af ​​niche-afhængige, ependymale effekter på NSC.

Protocol

ETIK ERKLÆRING: Denne protokol følger retningslinjerne for dyr pleje af universitetet i Valencia i overensstemmelse med EU-direktiv 2010/63 / EU. 1. generation af LV for In Vivo Mærkning Studier (se figur 1a) ADVARSEL: Den her beskrevne procedure er biosikkerhed niveau 2, derfor udføre alle følgende procedurer i en biologisk farlige hætte. Sørg for, at forskning personale er tilstrækkeligt kvalificeret og uddannet i alle procedurer. Brug personligt beskyttelsesudstyr, …

Representative Results

LV-medieret genlevering system kan anvendes til den langsigtede in vivo transduktion af celler i den voksne mus V-SVZ, så deres sporing og genetisk modifikation under proliferation, migration og differentiering. Infektionen og udtrykket er særdeles effektive og give talrige celler, som let kan skelnes blandt andre ikke-inficerede celler ved ekspressionen af ​​reporteren inkluderet. Vi har hidtil visualiseret transducerede celler med GFP fluorescerende reportere, drevet af den ubikvitært phosphoglyceratki…

Discussion

LVs tilbyder vigtige fordele frem for andre virale systemer til genetisk modifikation af voksne NSC'er ^16,18. Stereotaktisk levering af lentivira til V-SVZ'en niche repræsenterer en effektiv metode til at mærke og spore sjældent dividere B1-NSC'er overvinde begrænsningerne ved andre almindeligt anvendte metoder såsom BrdU, som fortyndes efter multiple celledelinger, eller retrovirus, som kun er målrettet celler som er prolifererende på tidspunktet for anvendelsen. LV'er sammen med adeno…

Materials

Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25X89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13X51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100×20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12×75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2X HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33-gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11×21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations