Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ'una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri
Summary
Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.
Abstract
Nispeten sakin somatik kök hücreler çoğu yetişkin dokularda yaşam boyu hücre yenilenmesini destekler. Yetişkin memeli beyninde sinir kök hücreleri iki özel nörojenik nişler ile sınırlıdır: hipokampus dentat girus ve ventriküler-subventricular bölgenin subgranuler kısmında lateral duvarlarında (V-SVZ'unda da subependimal bölgesi veya SEZ olarak adlandırılır) karıncıklar. Uzun süreli kök hücreleri istenen transgenlerin sentezlenmesi ve elde edilen döl elde yetişkin kök hücre popülasyonlarının in vivo gen transferi stratejilerinin geliştirilmesi (örneğin, memeli beyin olanlar) mevcut biyomedikal ve biyoteknolojik araştırma önemli bir araçtır. Burada, doğrudan in vivo yöntem, karaciğer hacimleri ile hücre döngüsü bağımsız enfeksiyon ve V-SVZ nişin çok özel hücre mimarisini yararlanır yetişkin fare V SVZ hücrelerinin kararlı genetik modifikasyon sunulmuştur. Özellikle, mevcut protokol dahilV-SVZ'unda kendisi ya spesifik transgen sentezleme kasetlerini şifreleyen boş Lys (kontrol) veya karaciğer hacimleri enjekte ependim hedeflenmesi için, in vivo niş hücrelerin her türlü hedefleme için, ya da lateral ventrikül lümenine, s hücreler sadece. İfade kasetleri daha sonra izin da karaciğer hacimleri ile kodlanan kalıt aktarımlı hücreler ve floresan proteinleri, genomu içine entegre edilmiştir etiketli hücre ve hücre bağımsız ve otonom-olmayan, niş bağımlı etkilerinin analizi için kalıt aktarımlı hücrelerin tespit kendi soy.
Introduction
fare ventrikül-subventricular bölgesi (V-SVZ), striatum bakan lateral ventrikül duvarlarında, çok aktif bir germinal bölge olduğu koku ampul kalıcı üretiminde progenitör hücre replikasyonu ve farklılaşma sonuçlarının sürekli bir süreç (OB ) internöron ve korpus kallosum oligodendrosit 1. , Astrositik antijen glial fibriller asidik protein (GFAP) ifade ve Nestin, ID1 olarak hücre belirteçleri kök, bu hücrelerin yaşam boyu nesil nöral kök hücreler (ayrıca B1 hücreleri olarak adlandırılan NSC'lerde) bu bölgede varlığı ile desteklenen gibi görünüyor ve Sox2 2. B1 hücreleri geçiş progenitör amplifiye transkripsiyon Dlx2 faktörleri ifade (TAP) hücreleri (Cı hücreleri) oluşturmak GFAP-sentezleyen (uzak-az homeobox 2) ve Ascl1 (memeli Achaete-Schute homologu 1) ve yol açmadan önce hızlı bir şekilde birkaç kez bölmek göç neuroblasts (A hücreleri) ya da oligodendroblasts 3. Silahların yayılması yeni oluşturulanliğine açık Nöroblastlar onlar granül ve farklılaştırılmış inhibitör olarak glomerüler katmanlara entegre OB, rostralinde göç akışı (RMS) oluşturan öne göç. Geçiş genç oligodendroblasts yerel olarak bölmek veya olgun Myelinating oligodendrositlere 1,4 içine ayırt etmeye devam olgunlaşmamış NG2-pozitif hücreler haline CC, hareket.
Fetal radyal glial hücrelerden elde B1 hücreleri, seleflerinin uzun ve polarize morfoloji korumak ve onların niş ile son derece uzmanlaşmış bir ilişki sergiler. Onlar hangi hatlar ventrikül ve V-SVZ niş sulamak kan damarlarının ağı yukarı ependima arasında kapsar. bazal süreç b bu niş biten sular düzlemsel vasküler pleksusu yaklaşım uzun mesafelerde uzanır oysa multiciliated ependymocytes arasında B1 hücreleri intercalates küçük apikal süreci ve tek bir non-motil birincil cilium biterpleksus kılcal damarların 2,5-8 arasında asal lamina.
Bozulmamış V-SVZ niş içinde de GFAP + non-nörojenik astrositler, B1-NSCs ayırt etmek en güvenilir yolu dayanmaktadır sonra 3-D konfokal mikroskobu ile ventrikül lateral duvar hazırlıklarını ve bunların analizlerini tüm montaj GFAP immün hücre zarlarını belirginleştiren ince B1-MGK apikal süreci, beta-katenin etiket ve her cilium 5,8 kapsamını etiket cilial bazal organları veya asetile α-tubulin bir belirteç olarak γ-tubulin birine. Ventriküler yüzeyinden bu tam bağlar Gözlemler B1 ve ependimal hücreleri bir veya birkaç GFAP + B1 hücreleri uniciliated apikal süreçleri multiciliated ependimal hücre rozet çevrili olduğu "pinwheels" 5, düzenlenmiş olduğunu göstermiştir.
B1 hücrelerinin karakteristik morfolojisi deneysel kanıt ile ilişkilidir iNSC'lerde 2,6,9-11 üzerinde etkili çözünür sinyallerin düzenlenmiş kaynakları teşkil kan damarlarını / endotel hücreleri ndicating ve beyin omurilik sıvısı (BOS) ventriküler. Ventriküler yüzey homotipik ve ependim B1 hücrelerini kapsayan heterotipik apico yanal etkileşimler sıkı kavşaklar ve adherens birleşme 5,12 içerir. Ayrıca, bu tür N-kaderin, V-CAM gibi B1 ve ependimal hücreleri arasında bağlantı komplekslerinde rol yapışma molekülleri, V-SVZ niş B1 yüksek organize konumlandırma sadece düzenleme gösterilmiştir, aynı zamanda sessizlik 12 13. Ependim-B1 hücre tekli-tabakası, bir difüzyon CSF su ve küçük moleküllerin düzenli bir akı sağlayan bir bariyer, ancak büyük proteinlerin 10,11 arası geçiş sınırlayıcı olarak hareket ettiği görülmektedir. Deneysel kanıtlar, benzersiz bir konuma sahip B1 hücresi apikal kirpik CSF 2 mevcut polipeptitleri sinyal bir sensör olarak bir rol oynayabileceğini göstermektedir5-7. Ependimal hücreleri per se NSC davranış 14,15 düzenlenmesinde bir rol ile çözünebilir ve zara bağlı sinyallerin bir kaynağıdır.
Örneğin bromo-deoksiüridin (BrdU) veya retrovirüsler gibi, izlenebilir nükleositler, yaygın olarak, in vivo olarak, NSC'lerde dahil projenitör hücreleri etiketlemek için kullanılmıştır. BrdU sinyalleri tekrarlanan hücre bölünmeleri ve retrovirüslerin ile sulandırmak tercihen iletimi 16,17 için hücre çoğalmasının onların ihtiyacına bağlı hücrelerin yükseltme geçici hedef görünür Ancak, bu yöntemler uzun vadeli kader izleme için uygun değillerdir. Niş bileşenleri ile etkileşim de dahil olmak üzere in vivo MGK fizyoloji, incelemek için, etiket ve B1-NSC'lerde büyük ölçüde durgun ve bunların komşu ependimal hücreler fizyolojik şartlar altında 3 bölmek asla, nadiren bölünen hücreleri izlemek için bir yöntem oluşturulması için çok önemlidir. Burada, lentiviral vektörler (LVs) yüksek verimli gen işareti izin olduğunu göstermektedirING ve kabiliyetleri transdüksiyonu için ve hücre devre bağımlı biçimde hedef hücrelerin genomu içine entegre için en uygun olan yetişkin NSC'lerde ve bölünmeyen ependim hücrelerin uzun süreli modifikasyonu. Ayrıca, biz teslim ve viral titre yardım rota özellikle böylece NSC'lerde üzerinde niş bağımlı, ependimal etkilerin analizi sağlayan B1 hücrelerini ependimal hücreleri nakletmek değil, nasıl gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
LVs yetişkin genetik modifikasyon NSC'lerde 16,18 için diğer viral sistemlere göre önemli avantajlar sunmaktadır. V-SVZ niş Lentivirüslerden stereotaksik teslim etiket ve sadece hücreleri hedef çoklu hücre bölünmeleri ya da retrovirüs sonra sulandırılır gibi BrdU gibi diğer yaygın olarak kullanılan yöntemler, sınırlamaları aşmak B1-NSCs bölen seyrek iz etkili bir yöntem temsil bu uygulama anındaki artıyor. LVs birlikte adenovirüs ile bağımsız olarak bisiklet durumunun hüc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz MJ Palop yardım ve Universidad de Valencia SCSIE teknik destek için minnettarım. Biz de yararlı yorumlar ve yazının tartışma için Antonia Follenzi teşekkür ederiz. onun Santander Üniversiteler Küresel Bölümü aracılığıyla Banco Santander tarafından Fundacion Botin, tarafından ve Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP ve ISIC) ve Ministerio de Economia y Competitividad hibe ile desteklenen IF (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED ve RETIC Tercel) . Bu çalışma aynı zamanda (260511- MINECO ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) 2012-StG gelen BFU2010-21823 ve RETIC Tercel hibe ile desteklenmiştir PD-HUMMODEL AC BM-P). MINECO bir İspanyol FPI burs almıştır.
Materials
| Part 1: Generation of LV for in vivo delivery. | |||
| Equipment: | |||
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XL-100K | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-28 | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-55 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 358126 | 25X89 mm |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | 13X51 mm |
| Ultracentrifuge adapters | Beckman Coulter | 358156 | |
| 6-well plate | SPL | PLC-30006 | |
| 24-well plate | SPL | PLC-30024 | |
| 10 cm dish | SPL | PLC-20101 | 100×20 style |
| FACS tubes | Afora | DE400800 | 12×75 mm, 5 ml |
| Cup sterile FACS filter | BD | 340626 | 30 µm |
| Nitrocellulose filter | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm |
| Flow cytometer | BD | LSR Fortessa | Blue laser 488 nm |
| Steritop filter | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 µm |
| Reagents: | |||
| pMDLg/pRRE plasmid | Addgene | #12251 | Core packaging plasmid |
| pRSV.REV plasmid | Addgene | #12253 | Core packaging plasmid |
| pMD2G plasmid | Addgene | #12259 | Envelope plasmid |
| pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid | Addgene | #12252 | Transfer vector plasmid |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowest | L0101-500 | For HeLa cell culture |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | For 293T cell culture |
| Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered | ||
| 2X HBS | 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530). | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X. |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100 | Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM. |
| Sodium pyruvate | Life technologies | 11360-039 | Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM. |
| GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water. |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | H9268 | Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O |
| Paraformaldehyde EM grade 16% | EM Sciences | 15710 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle. | |||
| Equipment: | |||
| Vernier stereotaxic instrument | NeuroLab, Leica | 39463001 | |
| Cunningham mouse and neonatal rat adaptor | NeuroLab, Leica | 39462950 | |
| Syringe holder | KD Scientific | KDS-311-CE | |
| 33-gauge syringe | Hamilton | P/N 84851/00 | #85RN |
| Electric drill | Fine Science Tool | 98096 | |
| Thermal blanket | Ufesa | AL5512/01 | 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01 |
| Shaver | Jata | MP373N | Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03. |
| Reagents: | |||
| Medetomidine | Esteve | DOMTOR | Comercial solution at 1 mg/ml. |
| Ketamine | Merial | Imalgene 500 | Comercial solution at 50 mg/ml |
| Medetomidina/ketamine mixture | Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight | ||
| Butorphanol | Pfizer | Torbugesic | Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution. |
| Atipamezole | Esteve | Antisedan | Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia. |
| 0.9% saline solution | Braun | 13465412 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | Topical skin adhesive |
| HydroGel | Clear H2O | 70-01-5022 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11×21 cm |
| Bleach/Virkon | Dupont | ||
| Surgical marker pen | Staedler | 313-9 | Permanent lumocolor |
| Ophthalmic lubricant | SICCAFLUID | 0.5 g/dosis, carbomer 974P | |
| Povidone-iodine | Betadine | 694109.6 | 10% povidone-iodine |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 3: Histological analysis. | |||
| Equipment: | |||
| Automatic peristaltic pump | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V |
| Pump head | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor |
| Silicone tube | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-96410-16 | Platinum L/S 16 |
| Scalp vein set | Vygon V-green | 70246.05T | 25G, 30 cm tube length |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Confocal microscope | Olympus | FluoView FV10i | |
| Hot plate | Tehtnica | SHP-10 | |
| Reagents: | |||
| Phosphate buffer (PB) | 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4 | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Panreac | 141451.1211 | Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB. |
| Saline solution | 0.9% NaCl in dH2O | ||
| Superglue | LOCTITE | 767547 | |
| Sodium azide | Panreac | 122712.1608 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100 | |
| Normal goat serum | Millipore | S30-100 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Detergent |
| Anti-GFP rabbit antibody | ROCKLAND | 600-401-215 | Use at a 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular probes | A-21206 | Use at a 1:750 dilution |
| 6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C. |
| Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | Mounting medium for fluorescent preparations |
References
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).
- Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone. Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).
- Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).
- Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. (39), (2010).
- Ramirez-Castillejo, C., et al. Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal. Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).
- Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow!. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Delgado, A. C., et al. Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction. Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).
- Kokovay, E., et al. VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression. Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).
- Porlan, E., et al. MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin. Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).
- Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain. Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).
- Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone. Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).
- Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. In vivo targeting of subventricular zone astrocytes. Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).
- Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).
- Consiglio, A., et al. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).
- Dull, T., et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Bomsel, M., Alfsen, A. Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).
- Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine. J Biomed Biotechnol. , (2010).
- Bonazzi, M., Cossart, P. Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection. J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).
- Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer. PLoS One. 8 (11), (2013).
- Yamashita, T., et al. Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
