Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

Summary

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Abstract

Relativamente células estaminais somáticas quiescentes apoiar a renovação celular ao longo da vida, na maioria dos tecidos adultos. As células estaminais neurais no cérebro de mamíferos adultos está restrita a dois nichos neurogénicos específicos: a zona subgranular do giro dentado no hipocampo e na zona ventricular-subventricular (V-SVZ; também denominada zona subependimal ou SEZ) nas paredes das laterais ventrículos. O desenvolvimento de estratégias de transferência in vivo de genes para as populações de células estaminais adultas (isto é, as do cérebro de mamíferos), resultando em expressão a longo termo de transgenes desejados nas células-tronco e a sua descendência resultante é uma ferramenta importante na investigação biomédica e biotecnológica corrente. Aqui, um método direto in vivo é apresentado para a modificação genética estável de células do rato adulto V-SVZ que se aproveita da infecção independente do ciclo celular por LVs ea citoarquitetura altamente especializada do nicho V-SVZ. Especificamente, o protocolo atual envolvems a injecção do LVS vazio (controlo) ou LVs que codificam as cassetes de expressão de transgenes específica para qualquer um do próprio V-SVZ, para o direccionamento in vivo de todos os tipos de células no nicho, ou para o lúmen do ventrículo lateral, para o direccionamento de ependimária células única. As cassetes de expressão são, em seguida, integrado no genoma das células transduzidas e proteínas fluorescentes, também codificados pelo LVS permitir a detecção das células transduzidas para a análise dos efeitos dependentes do nicho de células autónomos e não autónomos, em células marcadas e os seus progênie.

Introduction

A zona ventricular-subventricular murino (V-SVZ), nas paredes do ventrículo lateral de frente para o corpo estriado, é uma região germinal muito activa, na qual um processo contínuo de replicação de células progenitoras e diferenciação resulta na produção persistente de bolbo olfactivo (OB ) interneurônios e oligodendrócitos corpo caloso ^1. A geração ao longo da vida destas células parece ser apoiada pela presença nesta região de células neurais estaminais (NCCC, também chamado células B1), que expressam a proteína ácida fibrilar glial antigénio astrócitos (GFAP) e a haste marcadores celulares, tais como a nestina, Id1 e Sox2 ^2. GFAP-expressando células B1 gerar células (TAP) (células C), que expressam fatores de transcrição Dlx2 trânsito ampliando progenitor (distal-less homeobox 2) e Ascl1 (mamíferos achaete-Schute homólogo 1) e se dividem rapidamente algumas vezes antes de dar lugar a neuroblastos que migram (células a) ou oligodendroblasts ^3. Recém-gerado prolifneuroblasts operatória migrar anteriormente, formando o fluxo migratório rostral (RMS) para o OB, onde eles integrar o granular e camadas glomerular como interneurônios inibitórios diferenciados. A migração de jovens oligodendroblasts passar para o CC, onde eles se tornam células imaturas NG2-positiva que continuam a dividir localmente ou se diferenciar em oligodendrócitos myelinating maduros ^1,4.

células B1, que derivam de células gliais radiais fetais, retêm a morfologia alongada e polarizada de seus antecessores e exibem uma relação altamente especializada, com o seu nicho. Eles abrangem entre a ependyma que alinha o ventrículo e da rede de vasos sanguíneos que irrigam o nicho V-SVZ. O pequeno processo apical das células intercala B1 entre ependimócitos multiciliated e termina em um único cílio primária não-móveis, ao passo que o seu processo basal estende longas distâncias para abordar o plexo vascular planar que irriga este nicho final no blamina asal dos capilares do plexo ^2,5-8.

A maneira mais confiável para distinguir B1-NSCs a partir de astrócitos não-neurogênicas, que também são GFAP ^+, no nicho V-SVZ intacto é baseado em preparações com parede lateral do ventrículo e sua análise por microscopia confocal 3-D de toda a montar depois imunocoloração para GFAP para rotular o processo apical fina B1-NSC, β-catenina para delinear as membranas celulares, e ambos os γ-tubulina como um marcador de corpos basais cilial ou acetilado α-tubulina para rotular a extensão de cada cílio ^5,8. Observações destas montagens inteiras-a partir da superfície do ventrículo indicaram que as células ependimais e B1 estão dispostas em "" cata-ventos ^5, em que os processos apicais uniciliated de um ou vários GFAP ⁺ B1 células são cercadas por uma roseta de células ependimais multiciliated.

A morfologia característica de células B1 correlaciona-se com a evidência experimental indicating que os vasos sanguíneos / células endoteliais e ventriculares líquido cefalorraquidiano (LCR) constituem fontes reguladas de sinais solúveis que agem em NSCs ^2,6,9-11. Na superfície ventricular, homot�ica e interações APICO-lateral heterotípicos envolvendo células ependimárias e B1 incluem junções apertadas e junções aderentes ^5,12. Além disso, as moléculas de adesão implicados nos complexos juncionais entre as células B1 e ependimais, tais como N-caderina e V-CAM, têm sido mostrados para regular não só o posicionamento altamente organizada de B1 no nicho V-SVZ, mas também a sua quiescência ^{12 , 13.} A monocamada de células ependimária-B1 parece actuar como uma barreira de difusão, permitindo o fluxo regulado de água e pequenas moléculas a partir do CSF, mas restringindo a passagem de grandes proteínas intercelular ^10,11. A evidência experimental indica que o cílio apical de células B1 singularmente posicionada poderia desempenhar um papel como um sensor de sinalização polipeptídeos presentes no CSF ^2,5-7. Células ependimais são, por si só, também uma fonte de sinais solúveis e ligadas à membrana, com um papel na regulação do comportamento NSC ^14,15.

Rastreáveis ​​nucleósidos, tais como bromo-desoxiuridina (BrdU), ou retrovírus têm sido amplamente utilizados para marcar células progenitoras, incluindo as NSC, in vivo. No entanto, estes métodos não são ideais para o rastreio destino a longo prazo em virtude dos sinais de BrdU diluído através de divisões celulares utilizadas e retrovírus parecem ter como alvo, preferencialmente, de forma transiente células, devido à sua exigência de proliferação celular para a transdução ^16,17 amplificar. Para examinar NSC fisiologia in vivo, incluindo interações com componentes de nicho, é fundamental estabelecer um método para rotular e rastrear células raramente se dividem, como B1-NSCs são em grande parte de repouso e as suas células ependimárias vizinhos Nunca dividir em condições fisiológicas ^3. Aqui, mostramos que vetores de lentivírus (VEs) permitir a marca de gene de alta eficiênciação e modificação de longo prazo de NSC adultas e células ependimais que não se dividem, devido razoavelmente mais a sua capacidade para transduzir e a integrar-se no genoma das células alvo de um modo independente do ciclo celular. Além disso, mostramos como a rota de entrega e viral título de ajuda para transduzir especificamente células ependimárias, mas não células B1 permitindo assim a análise dos efeitos, ependimárias dependente de nicho no NSC.

Protocol

ÉTICA DECLARAÇÃO: Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da Universidade de Valência, em conformidade com a Directiva Europeia 2010/63 / UE. 1. Geração de LV para In Vivo Marcação Estudos (veja a Figura 1-A) CUIDADO: O procedimento aqui descrito é o nível de biossegurança 2, portanto, executar todos os procedimentos a seguir em uma capa de risco biológico. Garantir que o pessoal de investigação são devidamente qualificados e treinados em todos…

Representative Results

Sistema de entrega de genes mediada por LV pode ser utilizado para a longo prazo na transdução in vivo de células do ratinho adulto V-SVZ, permitindo que o seu controle e modificação genética durante a proliferação, a migração ea diferenciação. A infecção e a expressão são altamente eficazes e produzem numerosas células que podem ser facilmente distinguidos entre outras células não-infectadas por a expressão do repórter incluídos. Temos, assim, muito visualizado células transduzidas com G…

Discussion

LVs oferecer vantagens importantes sobre outros sistemas virais para a modificação genética de adultos NSCs ^16,18. entrega estereotáxica de lentivírus para o nicho V-SVZ representa um método eficiente para identificar e rastrear raramente dividindo B1-NSC superar as limitações de outros métodos vulgarmente utilizados tais como BrdU, que se dilui depois de múltiplas divisões celulares, ou retrovírus, que apenas células alvo que estão a proliferar no momento da aplicação. LVS juntamente com aden…

Materials

Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25X89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13X51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100×20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12×75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2X HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33-gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11×21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations