Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Summary

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Abstract

Relativ ruhig unterstützen somatische Stammzellen lebenslang die Zellerneuerung in den meisten adulten Geweben. Neurale Stammzellen im erwachsenen Gehirn von Säugetieren sind zwei spezifische neurogenen Nischen eingeschränkt: die Subgranularzone des Gyrus dentatus des Hippocampus und der ventrikulären-Subventrikularzone; in den Wänden der seitlichen (V-SVZ auch subependymale Zone oder SEZ bezeichnet) Ventrikel. Die Entwicklung von In-vivo-Gentransfer-Strategien für die adulte Stammzellpopulationen (dh diejenigen des Säugetiergehirns), die sich in langfristige Expression des gewünschten Transgene in den Stammzellen und deren abgeleiteten Nachkommen ist ein wichtiges Instrument in der aktuellen biomedizinischen und biotechnologischen Forschung. Hier wird eine direkte in vivo-Verfahren für die stabile genetische Veränderung von erwachsenen Maus V-SVZ Zellen präsentiert, die den Vorteil des Zellzyklus-unabhängig Infektion durch LVs und dem hoch spezialisierte Zellarchitektur des V-SVZ Nische findet. Insbesondere beinhalten die aktuelle Protokolls die Injektion von Leer LVs (Kontrolle) oder LVs kodiert bestimmten Transgen-Expressionskassetten entweder in die V-SVZ selbst, für den in-vivo-Targeting von allen Arten von Zellen in der Nische oder in die lateralen Ventrikel Lumen zum Targeting von ependymalen Zellen, die nur. Expressionskassetten werden dann in das Genom der transduzierten Zellen und fluoreszierende Proteine ​​integriert, die ebenfalls von dem LVs kodiert, erlauben die Detektion der transduzierten Zellen für die Analyse der Zelle autonom und nicht autonomen, Nische abhängige Effekte in den markierten Zellen und ihre Nachkommen.

Introduction

Die Maus-ventrikulären-Subventrikularzone (V-SVZ), in den Wänden des lateralen Ventrikel des Striatum zugewandt ist, ist eine sehr aktive Keimbereich, in dem ein kontinuierlicher Prozess der Vorläuferzellreplikation und Differenzierung ergibt sich die anhaltende Produktion von Riechkolben (OB ) Inter und Corpus callosum Oligodendrozyten ^1. Die lebenslange Erzeugung dieser Zellen wird durch die Anwesenheit in diesem Bereich von neuralen Stammzellen (NSC; auch als B1-Zellen) unterstützt werden, die die astrozytären Antigen glial fibrillary acidic protein (GFAP) und Stammzellmarker wie Nestin, Id1 auszudrücken und Sox2 ^2. GFAP-exprimierenden B1 Zellen erzeugen Transit Verstärken Vorläufer (TAP) Zellen (C-Zellen), die die Transkription DLX2 auszudrücken Faktoren (distal losen homeobox 2) und ASCL1 (mammalian Achaete-Schute homolog 1) und schnell zu einem mehrmals teilen, bevor sie Anlaß geben zu migrieren Neuroblasten (A-Zellen) oder oligodendroblasts ^3. Neu generierten prolifoperativen Neuroblasten Migration nach vorn, die rostralen Migrationsstrom (RMS) an den OB bildet, wo sie in dem körnigen und glomeruläre Schichten wie differenziert inhibitorischen Inter integrieren. Migrieren von jungen oligodendroblasts zur CC bewegen, wo sie unreif NG2-positive Zellen werden, die lokal oder differenzieren zu reifen myelinisierenden Oligodendrozyten ^1,4 weiter zu unterteilen.

B1-Zellen, die aus fötalen radialen Gliazellen ableiten, behalten die langgestreckte und polarisierte Morphologie ihrer Vorgänger und weisen eine hoch spezialisierte Beziehung zu ihrer Nische. Sie erstrecken sich zwischen dem Ependyms welche Linien der Herzkammer und dem Netzwerk von Blutgefäßen, die die V-SVZ Nische bewässern. Die kleine apikale Prozess der B1-Zellen lagert sich unter multiciliated ependymocytes und endet in einem unbeweglichen primären Zilien, während ihre basalen Prozess lange Strecken erweitert die planare Gefäßplexus zu nähern, die diese Nische Ende in der b bewässertasal Lamina des Plexus Kapillaren ^2,5-8.

Der zuverlässigste Weg B1-NSC aus nicht-neurogenen Astrozyten, die auch GFAP ^+, in der intakten V-SVZ Nische zu unterscheiden, basiert auf ganze Montage Zubereitungen der Ventrikel Seitenwand und deren Analyse durch 3-D konfokale Mikroskopie nach für GFAP Immunfärbung des dünnen B1-NSC apikalen Verfahren, β-Catenin zu beschriften Zellmembranen abzugrenzen, und entweder γ-Tubulin als Marker für cilial Basalkörpern oder acetyliertes α-Tubulin die Ausdehnung jeder cilium ^5,8 zu beschriften. Beobachtungen dieser Ganz Halterungen von der ventrikulären Oberfläche haben gezeigt, dass B1 und Ependymzellen in "pinwheels" ⁵ angeordnet sind, in denen die uniciliated apikale Prozesse eines oder mehrerer GFAP ⁺ B1-Zellen von einer Rosette aus multiciliated Ependymzellen umgeben sind.

Die charakteristische Morphologie von B1-Zellen korreliert mit experimentellen Beweis iRückenmarksflüssigkeit (CSF) bilden geregelt Quellen von löslichen Signale ndicating die Blutgefäße / Endothelzellen und ventrikuläre auf NSCs wirkenden ^2,6,9-11. An der ventrikulären Oberfläche, homotypische und hetero apikal-lateralen Wechselwirkungen zwischen ependymal und B1-Zellen gehören tight junctions und Adhärenzverbindungen ^5,12. Außerdem impliziert Adhäsionsmolekülen in den junctional Komplexen zwischen B1 und Ependymzellen, wie N-Cadherin und V-CAM, wurden in der V-SVZ Nische, sondern auch ihre Ruhe ¹² die hoch organisierten Positionierung von B1 nicht nur gezeigt, zu regulieren ^{, 13.} Die ependymalen-B1 Zellmonoschicht erscheint als eine Diffusionsbarriere zu wirken, um den geregelten Fluss von Wasser und kleinen Molekülen aus der CSF erlaubt, aber den Durchgang von großen interzellulären Proteinen ^10,11 einzuschränken. Experimentelle Daten zeigen, dass die einzigartig positioniert, B1 Zelle apikal Zilien eine Rolle als Sensor von Signalisierungs Polypeptide ² in der CSF spielen ^könnte,7.5. Ependymzellen sind an sich auch eine Quelle von löslichen und membrangebundenen Signale mit einer Rolle bei der Regulation von NSC Verhalten ^14,15.

Rückverfolgbar Nucleoside, wie Brom-desoxyuridin (BrdU) oder Retroviren sind weit zu beschriften Vorläuferzellen, einschließlich NSC, in vivo verwendet. Jedoch sind diese Methoden nicht optimal für die Rückverfolgung langfristige Schicksal weil BrdU Signale durch wiederholte Zellteilungen und Retroviren verdünnen erscheinen vorzugsweise vorübergehend an Zielzellen aufgrund ihrer Erfordernis der Zellproliferation zur Transduktion ^16,17 verstärken. NSC Physiologie in vivo, auch der Wechselwirkungen mit Nischen Komponenten zu untersuchen, ist es entscheidend, ein Verfahren zu etablieren selten teilende Zellen zu kennzeichnen und Spuren, als B1-NSCs weitgehend ruhig sind und deren Nachbar Ependymzellen nie ³ unter physiologischen Bedingungen unterteilen. Hier zeigen wir, dass lentivirale Vektoren (LVs) ermöglichen eine hocheffiziente Gen ZeichenIng und langfristige Änderung der Erwachsenen NSC und nicht teil Ependymzellen aufgrund meisten angemessen ihrer Fähigkeit zu transduzieren und in das Genom der Zielzellen in einer Zellzyklus-unabhängigen Weise zu integrieren. Darüber hinaus zeigen wir, wie die Route der Lieferung und virale Titer Hilfe speziell Ependymzellen transduzieren, aber nicht B1-Zellen wodurch die Analyse der Nische abhängig, ependymal Auswirkungen auf NSCs.

Protocol

Ethikerklärung: Dieses Protokoll folgt die Tierpflege-Richtlinien von der Universität von Valencia in Übereinstimmung mit den europäischen Richtlinie 2010/63 / EU. 1. Erzeugung von LV für In-vivo-Studien-Kennzeichnung (siehe 1A) ACHTUNG: Die hier beschriebene Verfahrensweise ist Biosicherheitsstufe 2, also alle die folgenden Verfahren in einem Biohazard Haube zuführen. Stellen Sie sicher, dass die Mitarbeiter in der Forschung entsprechend qualifiziert sind und in allen V…

Representative Results

LV-vermittelte Gen-Delivery-System kann für die Langzeit-in vivo Transduktion von Zellen in der adulten Maus V-SVZ verwendet werden, so dass ihre Verfolgung und genetische Veränderung während der Proliferation, Migration und Differenzierung. Die Infektion und die Expression sind hochwirksame und zahlreiche Zellen ergeben, die leicht zu unterscheiden und auch nicht-infizierten Zellen durch die Expression des Reporter aufgenommen werden können. Wir haben bisher transduzierten Zellen mit GFP fluoreszierenden R…

Discussion

LVs bieten wichtige Vorteile gegenüber anderen viralen Systemen für die genetische Veränderung von erwachsenen NSC ^16,18. Stereotaktische Lieferung von Lentiviren in die V-SVZ Nische stellt ein effizientes Verfahren zur Markierung und Spuren selten B1-NSC Aufteilen der Grenzen der anderen üblicherweise verwendeten Methoden wie BrdU zu überwinden, die nach mehreren Zellteilungen verdünnt wird, oder Retrovirus, das Zellen, die nur Ziel dass zum Zeitpunkt der Anwendung wuchern. LVs zusammen mit Adenoviren …

Materials

Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25X89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13X51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100×20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12×75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2X HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33-gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11×21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations