Summary

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

Published: February 17, 2016
doi:

Summary

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Abstract

יחסית בתאי גזע שקט סומטיים לתמוך התחדשות התאים לכל החיים ברוב רקמות בוגרות. תאי גזע עצביים במוח של יונקים בוגרים מוגבלים שתי גומחות נוירוגנית ספציפיים: אזור subgranular של gyrus משוננת בהיפוקמפוס ואת אזור חדרית-subventricular (V-SVZ; המכונה גם subependymal אזור או SEZ) בקירות של לרוחב חדרים. פיתוח אסטרטגיות העברת גני in vivo עבור אוכלוסיות תאי גזע בוגרים (כלומר אלה של מוח יונקים) וכתוצאה מכך ביטוי לטווח הארוך של transgenes הרצוי תאי הגזע וצאצאים הנגזרות מהם הוא כלי מרכזי במחקר ביו ביוטכנולוגיים הנוכחי. כאן, שיטה ישירה in vivo מוצגת לגבי ההנדסה הגנטית היציבה של תאי V-SVZ עכבר בוגר שמנצלת את זיהום המחזור עצמאי התא על ידי LVS ואת cytoarchitecture מאוד המיוחד של נישת V-SVZ. באופן ספציפי, הפרוטוקול הנוכחי לערבזה הזרקה של LVS ריק (שליטה) או LVS קידוד קלטות ביטוי transgene מסוים לתוך או V-SVZ עצמה, עבור in vivo מיקוד של כל סוגי התאים נישה, או לתוך לומן החדר לרוחב, עבור מיקוד של ependymal תאים בלבד. קלטות ביטוי אז הם משולבים לתוך הגנום של התאים transduced וחלבונים פלורסנט, מקודדים גם על ידי LVS, לאפשר זיהוי של תאי transduced לניתוח תא אוטונומיים ובלתי אוטונומיות, תופעות תלויות נישה בתאים שכותרתו שלהם צֶאֱצָאִים.

Introduction

אזור murine חדרית-subventricular (V-SVZ), בקירות החדר לרוחב מול בסטריאטום, הוא אזור נבטי מאוד פעיל בו תהליך מתמשך של תוצאות בידול שכפול תאים ובתאים בייצור מתמשך של הנורה חוש הריח (OB interneurons) ו oligodendrocytes כפיס המוח 1. הדור לכל החיים של תאים אלו מופיעים להיות נתמכים על ידי נוכחות באזור זה של תאי גזע עצביים (NSCs; המכונים גם תאי B1), המבטאים את חלבון גליה fibrillary חומצי אנטיגן astrocytic (GFAP) גזע סמני תא כגון nestin, ID1 ו Sox2 2. GFAP-לבטא בתאי B1 ליצור מעבר הגברה אבי תאים (TAP) (תאים C), המבטאים שעתוק גורמי Dlx2 (דיסטלי פחות homeobox 2) ו Ascl1 (homolog achaete-schute יונקים 1) ולחלק כמה פעמים במהירות לפני שהם להצמיח כדי neuroblasts הנודדת (תאי א) או oligodendroblasts 3. חדש שנוצר prolifneuroblasts erative להעביר anteriorly, ויצר נחל נודדות המקורי (RMS) אל OB, שם הם להשתלב הפרטניים ושכבות גלומרולרי כמו interneurons מעכבות בדיל. Oligodendroblasts הצעיר נודד לעבור CC, שם הם הופכים תאי NG2 חיובי מפותחים אשר ממשיכים להתחלק באופן מקומי או להתמיין oligodendrocytes myelinating הבוגר 1,4.

תאי B1, אשר נובעים ותאי גלייה רדיאלי עובריות, לשמר את המורפולוגיה המוארכת ומקוטבת של קודמיהם ולהציג מערכת יחסים מאוד מיוחדת עם הנישה שלהם. הם משתרעים בין התא אפנדימלי אילו קווים את החדר ואת הרשת של כלי דם להשקות את נישת V-SVZ. תהליך הפסגה הקטן של intercalates תאי B1 בין ependymocytes multiciliated ומסתיים cilium העיקרי יחיד שאינו ניע, ואילו התהליך הבסיסי שלהם משתרע למרחקים ארוכים להתקרב מקלעת כלי הדם מישוריים כי משקה סוף הנישה זו בlamina ASAL של נימי מקלעת 2,5-8.

הדרך האמינה ביותר להבחין B1-NSCs מ האסטרוציטים הלא נוירוגנית, שהן גם GFAP +, בגומחה V-SVZ שלם מבוסס על כל הר ההכנות של הקיר לרוחב החדר וניתוח שלהם על ידי מיקרוסקופ confocal 3-D אחרי immunostaining עבור GFAP לתייג את תהליך הפסגה B1-המל"ל דק, β-catenin להתוות קרום התא, ואו γ טובולין כסמן של גופים הבסיס cilial או acetylated α-טובולין לתייג את היקף כל cilium 5,8. תצפיות של כל-mounts אלה מפני שטח חדרית הראו כי תאי B1 ו- ependymal מסודרים "גלגלי רוח" 5, שבה תהליכי פסגת uniciliated של GFAP אחד או כמה + B1 תא מוקפים שושנה של תאי ependymal multiciliated.

המורפולוגיה האופיינית של תאי B1 בקורלציה עם ראיה נסיונית indicating כי כלי דם / תאי האנדותל חדרית נוזל השדרתי (CSF) מהווה מקורות מוסדרים של אותות מסיסים הפועלים NSCs 2,6,9-11. על פני החדר, homotypic ואינטראקציות apico-לרוחב heterotypic שמקורם בתאי דם ependymal ו- B1 כוללים צמתים הדוקים adherens צמתים 5,12. יתר על כן, מולקולות הדבקה מעורב מתחמי junctional בין התאים B1 ו- ependymal, כגון N-cadherin ו- V-CAM, הוכחו להסדיר לא רק את המיקום מאורגן של B1 בגומחה V-SVZ, אלא גם קפאון שלהם 12 , 13. Monolayer התא ependymal-B1 מופיע לפעול כמחסום דיפוזיה המאפשר השטף מוסדר מים ומולקולות קטנות מן CSF, אבל הגבלת המעבר בין תאית של חלבונים גדולים 10,11. ראיה נסיונית עולה כי cilium הפסגה בתא B1 ממוצבת באופן ייחודי יכול לשחק תפקיד כחיישן של איתות פוליפפטידים נוכח CSF 2,5-7. תאים Ependymal הם, כשלעצמם, גם מקור של אותות מסיסים קרום הנכנס עם תפקיד בוויסות התנהגות המל"ל 14,15.

נוקלאוזידים לעקיבה, כגון bromo-deoxyuridine (BrdU), או רטרווירוסים היה בשימוש נרחב לתייג ובתאים, כולל NSCs, in vivo. עם זאת, שיטות אלה אינן אופטימליים עבור מעקב גורל לטווח ארוך משום שאותות BrdU לדלל באמצעות חלוקות תא חוזרים רטרווירוסים נראה כי הן מיועדות מועדפות הגברה זמן תאים עקב הדרישה שלהם של התפשטות תאים עבור תמרת 16,17. כדי לבחון פיזיולוגית המל"ל in vivo, כולל אינטראקציות עם רכיבי נישה, חשוב להקים שיטה לתייג ואת העקבות לעתים נדירות תאים מתחלקים, כמו B1-NSCs הם שקט בעיקר ותאי ependymal השכנות שלהם מעולם לחלק בתנאים פיסיולוגי 3. כאן, אנו מראים כי וקטורים lentiviral (LVS) לאפשר סימן גן-יעילות גבוההing ושינוי ארוך הטווח של NSCs המבוגר ותאי ependymal הלא חלוקה, בשל בסבירות המרובה ליכולתם transduce וכדי להשתלב בגנום של תאי יעד באופן מחזור עצמאי תא. יתר על כן, אנו מראים כיצד תוואי עזרה כייל משלוח ויראלי transduce תאים ependymal במיוחד, אבל לא התאים B1 ובכך לאפשר ניתוח של תלויי נישה, תופעות ependymal על NSCs.

Protocol

המסר אתיקה: פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ולנסיה בהתאם להוראה אירופה 2010/63 / האיחוד האירופי. דור 1. של LV עבור In Vivo סימון מחקרים (ראה איור 1 א) זהירות: ההליך המתואר במס…

Representative Results

LV בתיווך מערכת מסירת גן יכולה לשמש לטווח הארוך תמרת vivo של תאי V-SVZ העכבר הבוגר, המאפשרת המעקב שלהם הנדסה גנטית במהלך התפשטות, הגירה והבחנה. הזיהום ואת הביטוי הוא יעיל ויניב תאים רבים ניתן להבחין בקלות בין תאים שאינם נגועים אחרים על ידי הביטוי של הכתב כלל. יש לנ…

Discussion

LVS להציע יתרונות חשובים על פני מערכות ויראליות אחרות עבור ההנדסה הגנטית של מבוגר NSCs 16,18. משלוח Stereotaxic של lentiviruses לנישה V-SVZ מייצג שיטה יעילה לתייג ואת עקבות חלוקת B1-NSCs לעתים רחוקות להתגבר על המגבלות של שיטות נפוצות אחרות כגון BrdU, אשר נחלש לאחר חלוקות תא מרובים, או רט…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים את עזרתו של MJ Palop ואת התמיכה הטכנית של SCSIE של ולנסיה Universidad de. אנו מודים גם אנטוניה Follenzi על הערות מועילות ודיון של כתב היד. אם הוא נתמך על ידי Fundacion Botìn, על ידי Banco Santander דרך חטיבת שלה סנטנדר אוניברסיטאות העולמי, ועל ידי מענקי Generalitat מוולנסיה (פרוגרמה Prometeo, ACOMP, ו ISIC) ו Ministerio דה Economìa y Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED ו RETIC Tercel) . עבודה זו נתמכה גם על ידי BFU2010-21823 ו RETIC Tercel המענק MINECO ואת מועצת המחקר האירופית (ERC) 2012-STG (260511- PD-HUMMODEL) אי.סי BM-P. הוא זכה במלגה FPI ספרדי של MINECO.

Materials

Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor Beckman Coulter SW-28
Ultracentrifuge rotor Beckman Coulter SW-55
Ultracentrifuge tubes  Beckman Coulter 358126 25X89 mm
Ultracentrifuge tubes  Beckman Coulter 326819 13X51 mm
Ultracentrifuge adapters Beckman Coulter 358156
6-well plate SPL PLC-30006
24-well plate SPL PLC-30024
10 cm dish SPL PLC-20101 100×20 style
FACS tubes Afora DE400800 12×75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter BD 340626 30 µm
Nitrocellulose filter Millipore SCGPU05RE 0.22 μm 
Flow cytometer BD LSR Fortessa Blue laser 488 nm
Steritop filter Biofil FPE-204-500  0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid  Addgene #12251 Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid  Addgene #12253 Core packaging plasmid
pMD2G plasmid  Addgene #12259 Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid  Addgene #12252 Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Biowest L0101-500 For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium  Life technologies 12440-053 For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE) Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2X HBS 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS) Biowest S181B-500 Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X.
Glutamine Sigma-Aldrich G7513-100 Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate Life technologies 11360-039 Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement Life technologies 35050-061 Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin Sigma-Aldrich P4458 Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056 With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS) Sigma-Aldrich D1408 Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)  Sigma-Aldrich H9268 Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O
Paraformaldehyde EM grade 16% EM Sciences 15710
Name Company Catalog Number Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument NeuroLab, Leica 39463001
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor NeuroLab, Leica 39462950
Syringe holder KD Scientific KDS-311-CE
33-gauge syringe Hamilton P/N    84851/00 #85RN
Electric drill Fine Science Tool 98096
Thermal blanket Ufesa AL5512/01 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver  Jata MP373N Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine Esteve DOMTOR  Comercial solution at 1 mg/ml. 
Ketamine Merial Imalgene 500  Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol Pfizer Torbugesic Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole Esteve Antisedan Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution Braun 13465412
Histoacryl Braun 1050052 Topical skin adhesive
HydroGel Clear H2O 70-01-5022
Kimwipes Kimberly-Clark 34120 11×21 cm
Bleach/Virkon Dupont
Surgical marker pen Staedler 313-9 Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant   SICCAFLUID 0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine Betadine 694109.6 10% povidone-iodine
Name Company Catalog Number Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump Cole-Parmer Inst. Co. HV-07524-55 Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head Cole-Parmer Inst. Co. HV-07518-00 Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube Cole-Parmer Inst. Co. HV-96410-16 Platinum L/S 16
Scalp vein set Vygon V-green 70246.05T 25G, 30 cm tube length
Vibratome Leica VT1000
Confocal microscope Olympus FluoView FV10i
Hot plate Tehtnica SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB) 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA) Panreac 141451.1211 Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution 0.9% NaCl in dH2O
Superglue LOCTITE 767547
Sodium azide Panreac 122712.1608
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100
Normal goat serum Millipore S30-100
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 Detergent
Anti-GFP rabbit antibody ROCKLAND 600-401-215 Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Molecular probes A-21206 Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G EM Sciences 17984-25 Mounting medium for fluorescent preparations

References

  1. Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).
  2. Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).
  3. Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone. Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).
  4. Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).
  5. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
  6. Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).
  7. Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
  8. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. (39), (2010).
  9. Ramirez-Castillejo, C., et al. Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal. Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).
  10. Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow!. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  11. Delgado, A. C., et al. Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction. Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).
  12. Kokovay, E., et al. VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression. Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).
  13. Porlan, E., et al. MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin. Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).
  14. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain. Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).
  15. Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone. Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).
  16. Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. In vivo targeting of subventricular zone astrocytes. Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).
  17. Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).
  18. Consiglio, A., et al. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).
  19. Dull, T., et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  20. Bomsel, M., Alfsen, A. Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).
  21. Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine. J Biomed Biotechnol. , (2010).
  22. Bonazzi, M., Cossart, P. Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection. J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).
  23. Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer. PLoS One. 8 (11), (2013).
  24. Yamashita, T., et al. Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).
  25. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).

Play Video

Cite This Article
Porlan, E., Martí-Prado, B., Consiglio, A., Fariñas, I. Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects. J. Vis. Exp. (108), e53282, doi:10.3791/53282 (2016).

View Video