तंत्रिका के विश्लेषण के लिए वयस्क माउस वी SVZ में कोशिकाओं की स्थिर और कुशल आनुवंशिक संशोधन स्टेम सेल स्वायत्त और गैर स्वायत्त प्रभाव
Summary
Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.
Abstract
अपेक्षाकृत मौन दैहिक स्टेम कोशिकाओं सबसे वयस्क ऊतकों में जीवन भर सेल नवीकरण समर्थन करते हैं। वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को दो विशिष्ट तंत्रिकाजन्य niches के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं: हिप्पोकैम्पस में दांतेदार गाइरस और वेंट्रिकुलर-subventricular क्षेत्र के subgranular क्षेत्र, पार्श्व की दीवारों में (वि SVZ भी subependymal जोन या सेज कहा जाता है) निलय। वयस्क स्टेम सेल आबादी के लिए इन विवो जीन स्थानांतरण रणनीतियों के विकास (यानी स्तनधारी मस्तिष्क के उन) स्टेम कोशिकाओं में वांछित transgenes की लंबी अवधि के अभिव्यक्ति और उनके ली गई संतान है, जिसके परिणामस्वरूप वर्तमान जैव चिकित्सा और जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उपकरण है। इधर, एक प्रत्यक्ष इन विवो विधि वयस्क माउस वी SVZ कोशिकाओं के स्थिर आनुवंशिक संशोधन कि LVS द्वारा कोशिका चक्र स्वतंत्र संक्रमण और वी SVZ आला के अति विशिष्ट cytoarchitecture का लाभ लेता है के लिए प्रस्तुत किया है। विशेष रूप से, वर्तमान प्रोटोकॉल शामिलखाली LVS (नियंत्रण) या LVS या तो वी SVZ ही में विशिष्ट transgene अभिव्यक्ति कैसेट एन्कोडिंग का इंजेक्शन है, आला में कोशिकाओं के सभी प्रकार के vivo को निशाना बनाने के लिए, या पार्श्व वेंट्रिकल लुमेन में, ependymal को निशाना केवल कोशिकाओं। अभिव्यक्ति कैसेट तो transduced कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट प्रोटीन, भी LVS द्वारा इनकोडिंग के जीनोम में एकीकृत कर रहे हैं, की अनुमति देने के लेबल की कोशिकाओं और सेल में स्वायत्त और गैर-स्वायत्त, आला-निर्भर प्रभाव के विश्लेषण के लिए transduced कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उनके संतान।
Introduction
murine वेंट्रिकुलर-subventricular क्षेत्र (वि SVZ), पार्श्व वेंट्रिकल स्ट्रिएटम का सामना करना पड़ की दीवारों में, एक बहुत सक्रिय कीटाणु क्षेत्र है जिसमें घ्राण बल्ब की लगातार उत्पादन में पूर्वज सेल प्रतिकृति और भेदभाव परिणामों की एक निरंतर प्रक्रिया (ओबी ) इन्तेर्नयूरोंस और महासंयोजिका oligodendrocytes 1। है, जो astrocytic प्रतिजन glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) को व्यक्त करने और इस तरह के nestin, ID1 के रूप में सेल स्टेम मार्कर, इन कोशिकाओं के आजीवन पीढ़ी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (बी 1 कोशिकाओं को भी बुलाया एनएससी) के इस क्षेत्र में मौजूदगी से समर्थन किया जाना प्रतीत होता है और Sox2 2। GFAP व्यक्त बी 1 कोशिकाओं पारगमन पूर्वज amplifying (नल) कोशिकाओं (सी कोशिकाओं), जो व्यक्त प्रतिलेखन कारक Dlx2 उत्पन्न (डिस्टल-कम homeobox 2) और Ascl1 (स्तनधारी achaete-schute Homolog 1) और तेजी से एक बार कुछ विभाजित करने से पहले वे जन्म दे पलायन neuroblasts (ए कोशिकाओं) या oligodendroblasts 3 करने के लिए। prolif नव जनितerative neuroblasts पूर्व की ओर पलायन, ओ, जहां वे बारीक और भेदभाव निरोधात्मक interneurons के रूप में glomerular परतों में एकीकृत करने के लिए व्याख्यान चबूतरे प्रवासी धारा (आरएमएस) के गठन। प्रवास के लिए जाते युवा oligodendroblasts सीसी, जहां वे अपरिपक्व NG2 पॉजिटिव कोशिकाओं है कि स्थानीय स्तर पर विभाजित या परिपक्व myelinating oligodendrocytes 1,4 में अंतर करने के लिए जारी बनने के लिए ले जाते हैं।
बी 1 कोशिकाओं है, जो भ्रूण के रेडियल glial कोशिकाओं से निकाले जाते हैं, अपने पूर्ववर्तियों की लम्बी और ध्रुवीकृत आकृति विज्ञान को बनाए रखने और अपने आला के साथ एक उच्च स्तरीय विशेषज्ञ रिश्ते दिखा रहे हैं। वे ependyma जो लाइनों वेंट्रिकल और रक्त वाहिकाओं है कि वी SVZ आला सिंचाई के नेटवर्क के बीच अवधि। multiciliated ependymocytes के बीच बी 1 कोशिकाओं intercalates के छोटे शिखर प्रक्रिया और, एक भी गैर गतिशील प्राथमिक बरौनी में समाप्त होता है, जबकि उनके बेसल प्रक्रिया लंबी दूरी फैली तलीय संवहनी जाल है कि ख में इस जगह को समाप्त सिंचाई के दृष्टिकोण के लिएजाल केशिकाओं 2,5-8 की asal पटल।
बाद माउंट पूरे 3-डी confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा वेंट्रिकल पार्श्व दीवार की तैयारियों और उनके विश्लेषण गैर तंत्रिकाजन्य astrocytes, जो भी कर रहे हैं GFAP + बरकरार वी SVZ आला में से B1-एनएससी भेद करने के लिए सबसे विश्वसनीय तरीका पर आधारित है GFAP के लिए immunostaining कोशिका झिल्ली को चित्रित करने के लिए पतली B1-एनएससी शिखर प्रक्रिया, β-catenin लेबल, और cilial बेसल निकायों या acetylated α ट्यूबिलिन के एक मार्कर प्रत्येक बरौनी 5.8 की हद लेबल करने के रूप में या तो γ ट्यूबिलिन करने के लिए। निलय सतह से इन पूरे आरोह की टिप्पणियों से संकेत दिया है कि बी 1 और ependymal कोशिकाओं "पिनव्हील" 5, जिसमें एक या कई GFAP + B1 कोशिकाओं के uniciliated शिखर प्रक्रियाओं multiciliated ependymal कोशिकाओं की एक थाली से घेर लिया जाता है में व्यवस्थित कर रहे हैं।
बी 1 कोशिकाओं की विशेषता आकृति विज्ञान प्रयोगात्मक सबूत के साथ संबद्ध मैंकि रक्त वाहिकाओं / endothelial कोशिकाओं ndicating और मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) वेंट्रिकुलर गठन एनएससी 2,6,9-11 पर अभिनय घुलनशील संकेतों के सूत्रों विनियमित। निलय सतह, homotypic और heterotypic apico पार्श्व ependymal और बी 1 कोशिकाओं को शामिल बातचीत पर तंग जंक्शनों और adherens जंक्शनों 5,12 शामिल हैं। इसके अलावा, इस तरह के आसंजन अणुओं एन cadherin और वी कैमरा के रूप में बी 1 और ependymal कोशिकाओं के बीच जंक्शनल परिसरों में फंसा, वि SVZ आला में बी 1 की न केवल अत्यधिक आयोजित स्थिति को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन यह भी उनकी निष्क्रियता 12 13। Ependymal-B1 सेल monolayer एक प्रसार बाधा सीएसएफ से पानी और छोटे अणुओं की विनियमित प्रवाह की अनुमति है, लेकिन बड़े प्रोटीन 10,11 के कहनेवाला पारित होने को सीमित करने के रूप में कार्य करने के लिए प्रकट होता है। प्रयोगात्मक सबूत इंगित करता है कि विशिष्ट रूप से तैनात बी 1 सेल शिखर बरौनी सीएसएफ 2 में मौजूद polypeptides संकेत के एक संवेदक के रूप में एक भूमिका निभा सकता है,5-7। Ependymal कोशिकाओं रहे हैं, असल में, एनएससी व्यवहार 14,15 के नियमन में एक भूमिका के साथ घुलनशील और झिल्ली ही सीमित संकेतों की भी एक स्रोत है।
ऐसे ब्रोमो-डिऑक्सीयूरिडीन (BrdU), या रेट्रोवायरस के रूप में मिल न्यूक्लियोसाइड, व्यापक रूप से, एनएससी सहित पूर्वज कोशिकाओं, लेबल को विवो में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन तरीकों क्योंकि BrdU संकेतों दोहराया कोशिका विभाजन और रेट्रोवायरस के माध्यम से पतला रियायत के पारगमन के लिए 16,17 सेल प्रसार की उनकी आवश्यकता के कारण कोशिकाओं amplifying क्षणिक निशाना बनाने के लिए दिखाई लंबी अवधि के भाग्य ट्रेसिंग के लिए इष्टतम नहीं कर रहे हैं। विवो में एनएससी शरीर क्रिया विज्ञान, आला घटकों के साथ बातचीत सहित जांच करने के लिए, लेबल और शायद ही कभी विभाजित कोशिकाओं का पता लगाने, के रूप में बी 1-एनएससी काफी हद तक मौन हैं और उनके पड़ोसी ependymal कोशिकाओं शारीरिक शर्तों 3 के तहत विभाजित कभी नहीं करने के लिए एक विधि की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम बताते हैं कि lentiviral वैक्टर (LVS) उच्च दक्षता जीन मार्क के लिए अनुमतिआईएनजी और वयस्क एनएससी और गैर विभाजित ependymal कोशिकाओं की लंबी अवधि के संशोधन, कारण transduce करने के लिए और एक सेल चक्र-स्वतंत्र तरीके से लक्ष्य कोशिकाओं के जीनोम में एकीकृत करने के लिए उनकी क्षमता के लिए सबसे उचित। इसके अलावा, हम कैसे वितरण और वायरल अनुमापांक मदद के मार्ग विशेष जिससे आला-निर्भर, एनएससी पर ependymal प्रभाव के विश्लेषण की अनुमति बी 1 कोशिकाओं ependymal कोशिकाओं transduce करने के लिए, लेकिन नहीं दिखा।
Protocol
Representative Results
Discussion
LVS वयस्क की आनुवंशिक संशोधन एनएससी 16,18 के लिए अन्य वायरल प्रणाली पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं। वी-SVZ आला करने के लिए lentiviruses के Stereotaxic वितरण लेबल और कभी कभी ट्रेस विभाजित B1-एनएससी ऐसे BrdU, के रूप में अन्य ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एम.जे. Palop की मदद और Universidad डी वालेंसिया के SCSIE की तकनीकी सहायता स्वीकार करते हैं। हम यह भी उपयोगी टिप्पणी और पांडुलिपि की चर्चा के लिए Antonia Follenzi धन्यवाद। यदि Fundación Botin, इसके Santander विश्वविद्यालयों नेटवर्किंग प्रभाग के माध्यम से बैंको Santander द्वारा, द्वारा और Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP, और आईएसआईसी) और Ministerio de Economia Y Competitividad से अनुदान द्वारा समर्थित है (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED और RETIC बाज़) । यह काम भी MINECO और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) 2012-एसटीजी से BFU2010-21823 और RETIC बाज़ अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (260511- पीडी-HUMMODEL) एसी बी एम पी करने के लिए। MINECO की एक स्पेनिश एफपीआई फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है।
Materials
| Part 1: Generation of LV for in vivo delivery. | |||
| Equipment: | |||
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XL-100K | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-28 | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-55 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 358126 | 25X89 mm |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | 13X51 mm |
| Ultracentrifuge adapters | Beckman Coulter | 358156 | |
| 6-well plate | SPL | PLC-30006 | |
| 24-well plate | SPL | PLC-30024 | |
| 10 cm dish | SPL | PLC-20101 | 100×20 style |
| FACS tubes | Afora | DE400800 | 12×75 mm, 5 ml |
| Cup sterile FACS filter | BD | 340626 | 30 µm |
| Nitrocellulose filter | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm |
| Flow cytometer | BD | LSR Fortessa | Blue laser 488 nm |
| Steritop filter | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 µm |
| Reagents: | |||
| pMDLg/pRRE plasmid | Addgene | #12251 | Core packaging plasmid |
| pRSV.REV plasmid | Addgene | #12253 | Core packaging plasmid |
| pMD2G plasmid | Addgene | #12259 | Envelope plasmid |
| pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid | Addgene | #12252 | Transfer vector plasmid |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowest | L0101-500 | For HeLa cell culture |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | For 293T cell culture |
| Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered | ||
| 2X HBS | 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530). | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X. |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100 | Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM. |
| Sodium pyruvate | Life technologies | 11360-039 | Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM. |
| GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water. |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | H9268 | Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O |
| Paraformaldehyde EM grade 16% | EM Sciences | 15710 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle. | |||
| Equipment: | |||
| Vernier stereotaxic instrument | NeuroLab, Leica | 39463001 | |
| Cunningham mouse and neonatal rat adaptor | NeuroLab, Leica | 39462950 | |
| Syringe holder | KD Scientific | KDS-311-CE | |
| 33-gauge syringe | Hamilton | P/N 84851/00 | #85RN |
| Electric drill | Fine Science Tool | 98096 | |
| Thermal blanket | Ufesa | AL5512/01 | 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01 |
| Shaver | Jata | MP373N | Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03. |
| Reagents: | |||
| Medetomidine | Esteve | DOMTOR | Comercial solution at 1 mg/ml. |
| Ketamine | Merial | Imalgene 500 | Comercial solution at 50 mg/ml |
| Medetomidina/ketamine mixture | Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight | ||
| Butorphanol | Pfizer | Torbugesic | Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution. |
| Atipamezole | Esteve | Antisedan | Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia. |
| 0.9% saline solution | Braun | 13465412 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | Topical skin adhesive |
| HydroGel | Clear H2O | 70-01-5022 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11×21 cm |
| Bleach/Virkon | Dupont | ||
| Surgical marker pen | Staedler | 313-9 | Permanent lumocolor |
| Ophthalmic lubricant | SICCAFLUID | 0.5 g/dosis, carbomer 974P | |
| Povidone-iodine | Betadine | 694109.6 | 10% povidone-iodine |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 3: Histological analysis. | |||
| Equipment: | |||
| Automatic peristaltic pump | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V |
| Pump head | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor |
| Silicone tube | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-96410-16 | Platinum L/S 16 |
| Scalp vein set | Vygon V-green | 70246.05T | 25G, 30 cm tube length |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Confocal microscope | Olympus | FluoView FV10i | |
| Hot plate | Tehtnica | SHP-10 | |
| Reagents: | |||
| Phosphate buffer (PB) | 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4 | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Panreac | 141451.1211 | Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB. |
| Saline solution | 0.9% NaCl in dH2O | ||
| Superglue | LOCTITE | 767547 | |
| Sodium azide | Panreac | 122712.1608 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100 | |
| Normal goat serum | Millipore | S30-100 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Detergent |
| Anti-GFP rabbit antibody | ROCKLAND | 600-401-215 | Use at a 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular probes | A-21206 | Use at a 1:750 dilution |
| 6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C. |
| Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | Mounting medium for fluorescent preparations |
References
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