Stabil og effektiv genmodifisering av Celler i Adult Mouse V-SVZ for Analyse av Neural Stem Cell autonome og ikke-autonome Effects

Summary

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Abstract

Relativt hvilende somatiske stamceller støtte livslang cellefornyelse i de fleste voksne vev. Neuralstamceller i den voksne hjernen hos pattedyr er begrenset til to bestemte nevrogene nisjer: den subgranular sonen av dentate gyrus i hippocampus og den ventrikulære-subventricular sone (V-SVZ; også kalt subependymal sone eller SEZ) i veggene av den laterale ventriklene. Utviklingen av in vivo genoverføring strategier for voksen stamcellepopulasjoner (dvs. de av hjernen hos pattedyr) som fører til langvarig ekspresjon av transgener i ønskede stamceller og deres avkom avledet er et viktig verktøy i dagens biomedisinsk forskning og bioteknologiske. Her er en direkte in vivo metode presenteres for stabil genmodifisering av voksen mus V-SVZ celler som utnyttet cellesyklus-uavhengig infeksjon ved LVS og høyt spesialiserte cytoarchitecture av V-SVZ nisje. Spesielt den gjeldende protokollen involveres injeksjon av tomme LVS (kontroll) eller LVS som koder for spesifikke transgen ekspresjonskassetter inn i enten den V-SVZ seg selv, for in vivo målsøking av alle typer celler i nisje, eller inn i laterale ventrikkel lumen, for målretting av ependymal celler bare. Ekspresjonskassetter blir deretter integrert inn i genomet av de transduserte celler og fluorescerende proteiner, også kodet for av LVS, tillater påvisning av de transduserte celler for analyse av celle-autonome og ikke-autonome, nisje-avhengige virkninger i de merkede celler og deres avkom.

Introduction

Den murine ventrikulære-subventricular sone (V-SVZ), i veggene i den laterale ventrikkel vender striatum, er en meget aktiv germinal region der en kontinuerlig prosess med stamcelle replikering og differensierings resulterer i vedvarende produksjon av luktelappen (OB ) interneurons og corpus callosum oligodendrocytes ^1. Den livslang generasjon av disse cellene ser ut til å bli støttet av nærværet i denne regionen av nevrale stamceller (NSC; også kalt B1-celler) som uttrykker den astrocytic antigenet glial fibrillært surt protein (GFAP) og stamcellemarkører som nestin, Id1 og Sox2 ^to. GFAP-uttrykk B1 celler generere transitt forsterke stamfar (TAP) celler (C celler), som uttrykker transkripsjon faktorer Dlx2 (distal-mindre homeobox 2) og Ascl1 (pattedyr achaete-Schute homolog 1) og dele seg raskt et par ganger før de gir opphav å migrere neuroblasts (A celler) eller oligodendroblasts ^3. Nylig generert formeringenregenerative neuroblasts migrere anteriorly, forming rostral vandrende stream (RMS) til OB, der de integreres i kornet og glomerulær lag som differensierte hemmende interneurons. Migrere unge oligodendroblasts flytte til CC, hvor de blir umodne NG2-positive celler som fortsetter å dele lokalt eller differensieres til modne myelinerende oligodendrocytter ^1,4.

B1 celler som stammer fra foster radiale gliaceller, beholde det langstrakte og polarisert morfologi av sine forgjengere og viser en svært spesialiserte forhold til sin nisje. De spenner mellom ependyma som linjer opp ventrikkelen og nettverket av blodkar som vanne V-SVZ nisje. Den lille apikale prosessen med B1 celler intercalates blant multiciliated ependymocytes og ender i en enkelt ikke-motile primære cilium, mens deres basal prosess strekker lange avstander for å nærme seg planar vaskulær plexus som vanner denne nisjen som slutter på basal lamina av plexus kapillærer ^2,5-8.

Den mest pålitelige måte å skille B1-NSCs fra ikke-nevrogene astrocytter, som også er GFAP ^+, i det intakte V-SVZ nisje er basert på hel-montere preparater av ventrikkelen sideveggen og deres analyse av 3-D konfokal mikroskopi etter farging for GFAP å merke den tynne B1-NSC apikal prosess, β-catenin å avgrense cellemembraner, og enten γ-tubulin som en markør for cilial basale organer eller acetylert α-tubulin å merke omfanget av hver cilium ^5,8. Observasjoner av disse hel-festene fra ventrikulære overflate har indikert at B1 og ependymal celler er anordnet i "små hjul" ^{til 5,} hvori de uniciliated apikale prosesser av en eller flere GFAP ⁺ B1 celler er omkranset av en rosett av multiciliated ependymal celler.

Den karakteristiske morfologi B1 celler korrelerer med eksperimentelle bevis indicating at blodkar / endotelceller og ventrikulære cerebrospinalvæsken (CSF) utgjør regulert kilder til løselig signaler som virker på NSCs ^2,6,9-11. På ventrikkel overflaten, homotypisk og heterotypic apico-lateral interaksjoner som involverer ependymal og B1 celler inkluderer trange veikryss og adherens veikryss ^5,12. Videre adhesjonsmolekyler innblandet i den synaptiske komplekser mellom B1 og ependymal celler, slik som N-cadherin og V-CAM, er blitt vist å regulere ikke bare den sterkt organisert posisjonering av B1 i den V-SVZ nisje, men også deres quiescence ^{12 , 13.} Den ependymal-B1 celle monosjikt synes å virke som en diffusjonsbarriere som tillater den regulerte strøm av vann og små molekyler fra CSF, men begrenser den intercellulære passasjen av store proteiner ^10,11. Eksperimentelle studier indikerer at en unik posisjon B1 celle apikal cilium kan spille en rolle som en sensor signal polypeptider stede i CSF ^2,5-7. Ependymal celler er i og for seg også en kilde av oppløselige og membranbundne signaler med en rolle i reguleringen av NSC oppførsel ^14,15.

Spor nukleosider, som for eksempel brom-deoksyuridin (BrdU) eller retrovirus har blitt mye brukt til å merke stamceller, inkludert NSCs, in vivo. Imidlertid er disse fremgangsmåter ikke er optimale for langvarig skjebne tracing fordi BrdU signaler fortynne gjennom gjentatte celledelinger og retroviruser ut til fortrinnsvis å målrette forbigående forsterkning av cellene på grunn av deres behov av celleproliferasjon for transduksjon ^16,17. For å undersøke NSC fysiologi in vivo, inklusive samhandling med nisje komponenter, er det avgjørende å etablere en metode for å merke og spore sjelden dele celler, som B1-NSCs er i stor grad stillestående og sine naboland ependymal celler aldri dele under fysiologiske betingelser ^3. Her viser vi at lentiviral vektorer (LVS) gir mulighet for høy effektivitet genet marking og langvarig modifikasjon av voksne NSCs og ikke-delende celler ependymal, på grunn av de rimelige til deres evne til å omsette og å integrere i genomet av målceller i en cellesyklus-uavhengig måte. Videre viser vi hvordan rute for levering og viral titer hjelp til spesielt transduce ependymal celler, men ikke B1 celler og dermed gir analysen av nisje-avhengige, ependymal effekter på NSC.

Protocol

ETIKK UTTALELSE: Denne protokollen følger retningslinjene dyr omsorg ved University of Valencia i samsvar med EU-direktiv 2010/63 / EU. 1. Generering av LV for In Vivo Merking Studies (se Figur 1a) FORSIKTIG: Prosedyren er beskrevet her er biosikkerhetsnivå 2, derfor utføre alle følgende prosedyrer i en biohazard hette. Sikre at forsknings personell er tilstrekkelig kvalifisert og opplært i alle prosedyrer. Bruk personlig verneutstyr, inkludert kappe, doble hansk…

Representative Results

LV-formidlet gen-avgivelsessystem kan benyttes for den langsiktige in vivo transduksjon av celler i den voksne mus V-SVZ, slik at deres sporing og genetiske endringer i løpet av proliferasjon, migrering og differensiering. Infeksjonen og uttrykket er meget effektive og gir tallrike celler som lett kan skilles blant de ikke-infiserte celler ved ekspresjon av reporter inkludert. Vi har så langt visualisert transduserte celler med GFP fluorescerende reportere, drevet av den allestedsnærværende uttrykt fosfogly…

Discussion

LVS gir viktige fordeler fremfor andre virussystemer for genmodifisering av voksen NSCs ^16,18. Stereotaxic levering av lentiviruses til V-SVZ nisje representerer en effektiv metode for å merke og spore sjelden dele B1-NSCs vinne begrensninger av andre vanlig brukte metoder som BrdU, som er utvannet etter flere celledelinger, eller retrovirus, som bare målceller som formerer seg i øyeblikket av søknaden. LVS, sammen med adenovirus kan infisere cellene uavhengig av deres sykling status, og dette er spesielt…

Materials

Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25X89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13X51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100×20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12×75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2X HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33-gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11×21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations