Stable et efficace modification génétique de cellules dans le Adulte souris V-SVZ pour l'analyse des cellules souches neurales autonome et effets non autonomes

Summary

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Abstract

Relativement cellules souches somatiques repos appuyer le renouvellement cellulaire long de la vie dans la plupart des tissus adultes. les cellules souches neurales dans le cerveau adulte de mammifère sont limités à deux niches neurogènes spécifiques: la zone sous-granulaire du gyrus denté de l'hippocampe et la zone ventriculaire-ventriculaire (V-SVZ; également appelé zone épendymaire ou SEZ) dans les parois latérales ventricules. Le développement de vivo stratégies de transfert de gène pour les populations de cellules souches adultes (ceux du cerveau des mammifères) résultant de l'expression à long terme de transgènes souhaités dans les cellules souches et de leur descendance issue est un outil essentiel dans la recherche biomédicale et biotechnologique actuelle. Ici, une méthode in vivo directe est présentée pour la modification génétique stable de cellules V-SVZ souris adulte qui tire parti de la cellule indépendante du cycle infection par VL et l'cytoarchitecture hautement spécialisée de la niche de V-SVZ. Plus précisément, le protocole actuel impliques l'injection de volumes logiques vides (témoins) ou VL codant pour des cassettes d'expression spécifique d'un transgène soit dans le V-SVZ lui-même, pour le ciblage in vivo de tous les types de cellules dans la niche ou dans la lumière du ventricule latéral, pour le ciblage des épendymaire cellules seulement. Les cassettes d'expression sont ensuite intégrés dans le génome des cellules transduites et des protéines fluorescentes, également codées par le LV, permettre la détection des cellules transduites pour l'analyse de cellules effets autonomes et non autonomes, niche-dépendante dans les cellules marquées et leur progéniture.

Introduction

La zone ventriculaire-ventriculaire murin (V-SVZ), dans les parois du ventricule latéral face au striatum, est une région germinal très actif dans lequel un processus continu de réplication de cellules souches et de différenciation des résultats dans la production persistante du bulbe olfactif (OB ) interneurones et les oligodendrocytes corps calleux ^1. La génération permanente de ces cellules semble être soutenu par la présence dans la région de cellules neuronales souches (les NSC, également appelées cellules B1), qui expriment l'antigène astrocytaire protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et de la tige marqueurs cellulaires tels que la nestine, Id1 et Sox2 ^2. GFAP cellules exprimant B1 génèrent transit amplifier progénitrices (TAP) (cellules C), qui expriment les facteurs de transcription Dlx2 (distal-less homeobox 2) et Ascl1 (mammifère Achaete-Schute homologue 1) et de diviser rapidement un certain nombre de fois avant qu'ils ne donnent lieu à la migration des neuroblastes (cellules A) ou oligodendroblasts ^3. Nouvellement généré prolifneuroblastes ratives migrent en avant, formant le courant de migration rostrale (RMS) de l'OB, où ils intègrent dans le granulaire et couches glomérulaire interneurones inhibiteurs différenciés. Migration jeunes oligodendroblasts passer à la CC, où ils deviennent des cellules NG2 positif immatures qui continuent de diviser localement ou se différencier en oligodendrocytes myélinisantes matures ^1,4.

cellules B1, qui dérivent de cellules gliales radiales fœtales, conservent la morphologie allongée et polarisée de leurs prédécesseurs et présentent une relation hautement spécialisée avec leur niche. Ils couvrent entre l'épendyme qui aligne le ventricule et le réseau de vaisseaux sanguins qui irriguent le créneau de la V-SVZ. Le petit processus apicale des cellules B1 intercale entre ependymocytes multiciliées et se termine en un seul cil primaire non mobiles, alors que leur processus de base étend de longues distances pour approcher le plexus vasculaire plane qui irrigue ce créneau fin dans le basal lamina des capillaires du plexus ^2,5-8.

Le moyen le plus fiable de distinguer B1-NSCs des astrocytes non neurogène, qui sont aussi GFAP ^+, dans le créneau intacte de V-SVZ est basé sur l'ensemble du montage des préparations de la paroi latérale du ventricule et leur analyse par 3-D microscopie confocale après immunocoloration pour GFAP d'étiqueter la mince processus apical B1-NSC, β-caténine pour délimiter les membranes cellulaires, et soit γ-tubuline comme un marqueur de corps basaux ciliaire ou acétylée α-tubuline pour marquer la mesure de chaque cil ^5,8. Observations de ces entiers montures de la surface ventriculaire ont indiqué que les cellules B1 et épendymaires sont disposés en "soleils" ^5, dans lequel les processus apical uniciliated d'un ou de plusieurs GFAP ⁺ B1 cellules sont encerclés par une rosette de cellules épendymaires multiciliées.

La morphologie caractéristique des cellules B1 est en corrélation avec des données expérimentales indicating que les vaisseaux sanguins / cellules endothéliales et ventriculaire liquide céphalo-rachidien (LCR) constituent des sources réglementées de signaux solubles agissant sur ​​NSCs ^2,6,9-11. À la surface ventriculaire, homotypique et interactions apico-latérale hétérotypiques impliquant des cellules épendymaires et B1 inclure jonctions serrées et jonctions adhérentes ^5,12. En outre, les molécules d'adhésion impliquées dans les complexes de jonction entre les cellules B1 et épendymaires, tels que la N-cadhérine et V-CAM, il a été démontré pour réguler non seulement la mise en place très organisée de B1 dans le créneau de V-SVZ, mais aussi leur quiescence ^{12 , 13.} La monocouche de cellules épendymaires-B1 semble agir comme une barrière de diffusion permettant au flux régulé d'eau et de petites molécules à partir de la peste porcine classique, mais en limitant le passage de grosses protéines intercellulaire ^10,11. Des expériences montrent que la cellule B1 cil apical position unique pourrait jouer un rôle en tant que capteur de polypeptides présents dans le LCR ² de ^{signalisation,}7.5. Cellules épendymaires sont, en soi, une source de signaux solubles et membranaires avec un rôle dans la régulation du comportement NSC ^14,15.

Traçables nucleosides, tels que bromo-désoxyuridine (BrdU) ou des rétrovirus ont été largement utilisés pour marquer les cellules progénitrices, y compris NSC, in vivo. Cependant, ces procédés ne sont pas optimales pour le traçage destinée à long terme parce que les signaux de BrdU dilué par divisions cellulaires et des retrovirus répétées apparaissent de manière transitoire pour cibler préférentiellement les cellules d'amplification en raison de leur exigence de la prolifération cellulaire de transduction ^16,17. Pour examiner NSC physiologie in vivo, y compris les interactions avec des composants de niche, il est crucial d'établir une méthode d'étiqueter et de tracer les cellules en division rarement, comme B1-CSN sont en grande partie de repos et leurs cellules épendymaires voisins ne se divisent dans les conditions physiologiques ^3. Ici, nous montrons que les vecteurs lentiviraux (LV) permettent à haut rendement gène marquement et la modification à long terme du CNS adultes et les cellules épendymaires ne se divisant pas, en raison de la plus raisonnable de leur aptitude à la transduction et l'intégration dans le génome des cellules cibles d'une manière indépendante du cycle cellulaire. En outre, nous montrons comment la voie d'administration et virale titre d'aide pour la transduction spécifiquement les cellules épendymaires, mais pas les cellules B1 permettant ainsi l'analyse des effets, épendymaires de niche dépendant sur NSC.

Protocol

ÉTHIQUE ÉTAT: Ce protocole suit les directives de protection des animaux de l'Université de Valence en conformité avec la directive européenne 2010/63 / UE. 1. Génération de LV pour In Vivo Marquage études (voir la figure 1a) ATTENTION: La procédure décrite ici est du niveau de biosécurité 2, donc effectuer toutes les procédures suivantes dans une hotte de risque biologique. Veiller à ce que le personnel de recherche sont dûment qualifiés et formés dans to…

Representative Results

Système de distribution à médiation par le gène LV peut être utilisé à long terme dans la transduction in vivo des cellules de la V-SVZ de souris adulte, ce qui permet leur repérage et la modification génétique au cours de prolifération, la migration et la différenciation. L'infection et l'expression sont très efficaces et produisent de nombreuses cellules qui peuvent être facilement distingué parmi d'autres cellules non-infectées par l'expression de la journaliste inclus. Nous a…

Discussion

LV offrent des avantages importants par rapport à d'autres systèmes viraux pour la modification génétique des adultes NSCs ^16,18. livraison stéréotaxique des lentivirus à la niche de V-SVZ représente une méthode efficace pour étiqueter et tracer rarement divisant B1-CSN surmonter les limites des autres méthodes couramment utilisées telles que BrdU, qui est dilué après de multiples divisions cellulaires, ou rétrovirus, qui ne ciblent les cellules qui prolifèrent au moment de l'applicati…

Materials

Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25X89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13X51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100×20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12×75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2X HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100X, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10X.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10X, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1X PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1000X stock solution at 8 mg/ml in dH2O
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33-gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11×21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations