Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier
Summary
Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.
Abstract
Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.
Introduction
De nucleaire enveloppe (NE) scheidt de nucleoplasma van het cytoplasma. Het bestaat uit een binnenste en buitenste kernmembraan (INM en ONM, respectievelijk) die aansluiten op kernporiën. De lumen afgebakend door beide membranen heet de perinucleaire ruimte (PNS). De ONM is een uitbreiding van het ruwe endoplasmatisch reticulum (ER) en de INM hecht aan de nucleaire lamina, een maaswerk van nucleaire type V intermediaire filamenten vertegenwoordigers A- en B-type lamins 1,2. Linkers van het Nucleoskeleton cytoskelet (LINC) complexen macromoleculaire samenstellingen die de gehele kern envelop overspannen fysiek het inwendige van de kern verbinden met cytoskelet filamenten en moleculaire motoren (figuur 1A). Ze bestaan uit interacties tussen evolutionair geconserveerde motieven die twee families van integrale transmembraaneiwitten van de NE karakteriseren: Zon (Sad1 / Unc84) eiwitten en Nesprins (Nuclear Envelope SPectRINS). Bij zoogdieren, sun1 en Sun2 are transmembraaneiwitten van de INM waarvan N-terminale gebied nucleoplasmatische interageert direct met A- en B-type lamins 3-5. Aan de andere kant van de INM binnen de PNS, Zon eiwitten haven een evolutionair geconserveerde gedeelte van ~ 150 C-terminale aminozuren genoemd SUN domein. SUN domeinen interactie rechtstreeks met de evolutionaire-geconserveerde KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne homologie) domein, de moleculaire ondertekening van Nesprins. KASH domeinen bestaan uit een stuk ~ 30 C-terminale aminozuren die uitsteekt in het PZS, gevolgd door een transmembraandomein 6. Ten minste vier verschillende Nesprin genen (Nesprin1-4) coderen KASH bevattende eiwitten die lokaliseren op de NE 7. De cytoplasmatische regio Nesprins, waarvan de afmetingen variëren van ~ 50 kDa (Nesprin4) een verbazingwekkende 1000 kDa (Nesprin1 reus), bevatten meerdere spectrin herhaald en specifieke motieven waarmee de interactie met cytoskelet componenten zoals actine, plectine en moleculaire motoren 8- 13.
<p class = "jove_content"> Studies bij gewervelde en ongewervelde dieren hebben aangetoond dat Lamin / Zon / Nesprin / moleculaire motoren vormen een evolutionair geconserveerd "as" beheersen van nucleaire migratie en verankering. Verschillende knock-out (KO) muismodellen van LINC complexe componenten zijn beschreven en waren instrumentaal in een kader om de rol van de Zon en Nesprin eiwitten in het NE begrijpen tijdens zoogdieren ontwikkeling 9,14,15. Echter, deze modellen huidige aantal belangrijke nadelen, met name: 1) moeilijkheden bij de interpretatie fenotypes als gevolg van niet-autonome effecten, 2) moeilijkheden cel onderscheiden de fenotypische bijdragen van KASH bevattende vs. KASH-less Nesprin isovormen 16, 3) het functionele redundantie van Sun en Nesprin eiwitten in het NE in talrijke celtypen vereist complexe fokprogramma's om alle SUN-KASH interacties in muizen 17 en 4) van de perinatale sterfte van muizen deficiënt voor de KASH-domein van zowel inactiverenNesprins1 en 2 zich verzet tegen de analyse van de volwassen fenotypen 18.Dit protocol beschrijft een nieuw muismodel ontworpen om alle SUN-KASH interacties in vivo te verstoren, in een cel autonome ontwikkeling gereguleerde wijze, zonder daarbij veel van de bovengenoemde nadelen. Dit Cre /-lox gebaseerde muismodel voert twee begrippen: 1) de KASH domein van elke bekende Nesprin eiwit is voldoende om EGFP richten op NO in celkweeksystemen en 2) SUN domeinen wisselwerking promiscuously met KASH domeinen, waardoor overexpressie van elke KASH domein alle endogene SUN domeinen verzadigen en inactiveren LINC complexen in een dominant-negatieve manier 17 (Figuur 1B). Dit protocol beschrijft weefsel oogsten en verwerken stappen gebruikt om de verstoring van SUN-KASH interacties in cerebellaire Purkinje cellen bevestigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stap om met succes de studie van de rol van LINC complexen in vivo met behulp van de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) model is om een geschikte Cre muis regel (s) te identificeren. Inderdaad, als Cre actief in andere celtypes zijn betrokken bij soortgelijke trajecten, kan de interpretatie van de resultaten bemoeilijkt. Daarom is het belangrijk om nabijgelegen cellen te onderzoeken, zoals hier in de moleculaire en granulaat cellagen van het cerebellum (Figuur 2B). Ook elke fysiologi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken het personeel van de morfologie en Imaging kern van de Moleculaire Genetica kern (afdeling Oogheelkunde en Visual Sciences) en van de Muis Genetica Core aan de Washington University in St. Louis School of Medicine. De auteurs worden ondersteund door de kleine subsidieprogramma van de McDonnell Centrum voor Cellulaire en Moleculaire Neurobiologie, de Hoop Centrum voor Neurologische Aandoeningen, de National Eye Institute (# R01EY022632 naar DH), een Nationaal Instituut Eye Center Core Grant (# P30EY002687) en een onbeperkte subsidie van Onderzoek naar blindheid te voorkomen dat de afdeling Oogheelkunde en Visual Sciences.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
