אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא
Summary
Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.
Abstract
Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.
Introduction
מעטפת הגרעין (NE) מפרידה nucleoplasm מציטופלסמה. הוא מורכב מקרום פנימי וחיצוני גרעיני (INM וONM, בהתאמה) המתחברים בנקבוביות גרעיניות. לומן שמסומן על ידי שני הקרומים נקרא חלל perinuclear (PNS). ONM היא הרחבה של הרשתית מחוספס endoplasmic (ER), וINM שומר על lamina הגרעיני, meshwork של חוטי ביניים מסוג V הגרעיני מיוצג על ידי א 'וב' מסוג lamins 1,2. Linkers של Nucleoskeleton ומתחמי נוגדנים (LINC) הם מכלולי macromolecular כי היקף כל מעטפת הגרעין להתחבר פיזי הפנימית של הגרעין לחוטי cytoskeletal ומנועים מולקולריים (איור 1 א). הם מורכבים מאינטראקציות בין מוטיבים שמורים באבולוציה המאפיינים את שתי משפחות של חלבונים הטרנסממברני נפרד מNE: חלבוני שמש (Sad1 / Unc84) וNesprins (גרעיני המעטפה SPectRINS). ביונקים, ar Sun1 וSun2חלבונים הטרנסממברני דואר של INM שN-מסוף nucleoplasmic אזור אינטראקציה ישירות עם A- וlamins B-סוג 3-5. בצד השני של INM, בתוך PNS, חלבוני שמש נמל מתיחה שימור האבולוציוני של ~ חומצות אמינו 150 C-מסוף נקראות תחום SUN. תחומים SUN אינטראקציה ישיר עם קאש-שימור אבולוציוני (Klarsicht / Anc-1, עברו" הומולוגיה) תחום, החתימה המולקולרית של Nesprins. תחומים קאש מורכבים ממתיחה של ~ 30 חומצות אמינו C-מסוף שבולטת לתוך PNS ואחריו תחום הטרנסממברני 6. לפחות ארבעה גנים שונים Nesprin (Nesprin1-4) לקודד קאש המכיל חלבונים שלמקם בNE 7. אזורי cytoplasmic של Nesprins, הגדלים משתנים מ~ 50kDa (Nesprin4) למדהים 1,000 kDa (ענק Nesprin1), מכילים spectrin מרובה חוזר כמו גם מוטיבים מסוימים המאפשר האינטראקציה שלהם עם רכיבי cytoskeletal כגון אקטין, plectin ומנועים מולקולריים 8 13.
<class = "jove_content" p> מחקרים בבעלי חוליות וחסרי חוליות הראו כי Lamin / מנועים מולקולריים שמש / Nesprin / מהווים "ציר" אבולוציונית שימור שליטה הגירה ומעגן גרעיניים. מודלים עכבר נוק-אאוט כמה (KO) של רכיבים מורכבים LINC תוארו וסייעו במתן מסגרת להבנת התפקידים של חלבוני שמש וNesprin בNE במהלך התפתחות יונקים 9,14,15. עם זאת, מודלים אלה כמה חסרונות הנוכחיים משמעותיים, בעיקר: 1) קושי בפרשנות פנוטיפים בשל תא השפעות חד-אוטונומיות, 2) קושי בהבחנה תרומות phenotypical של קאש המכילים לעומת קאש-פחות Nesprin isoforms 16, 3) יתירות פונקציונלית של חלבוני שמש וNesprin בNE בסוגים רבים של תאים דורשת תוכניות רבייה מורכבות כדי להשבית את כל אינטראקציות SUN-קאש בעכברים 17 ו -4) קטלני סביב הלידה של עכברים החסרות לקאש-תחום של שניNesprins1 ו -2 מונעים את הניתוח של מבוגרים פנוטיפים 18.פרוטוקול זה מתאר מודל רומן עכבר נועד לשבש את כל אינטראקציות SUN-קאש in vivo, בתא אופן אוטונומי ומוסדר מבחינה התפתחותית, ובכך עוקף רב של החסרונות שתוארו לעיל. Cre / מודל עכבר מבוסס לקס זה מסתמך על שני מושגים חשובים: 1) תחום קאש של כל חלבון Nesprin ידוע מספיק כדי למקד EGFP לNE במערכות תרבית תאים ו -2) תחומים SUN אינטראקציה עם אבחנת תחומים קאש, כך ביטוי יתר של כל תחום קאש יהיה להרוות כל תחומי SUN אנדוגני ולהשבית מתחמי LINC באופן דומיננטי שלילי 17 (איור 1). פרוטוקול זה מתאר קצירת רקמה ומדרגות עיבוד משמשות כדי לאשר את השיבוש של כל אינטראקציות SUN-קאש בתאי פורקינג 'במוח הקטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב הקריטי ביותר ללמוד בהצלחה את התפקיד של מתחמי LINC in vivo באמצעות מודל Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) הוא לזהות קו מתאים Cre עכבר (ים). ואכן, אם Cre הוא פעיל בתא-סוגים אחרים מעורבים במסלולים דומים, זה יכול לסבך את הפרשנות של התוצאות. לפיכך, חשוב לבחון תאים סמוכים, כפי שמוצגים כאן בשכבו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לצוות ליבת המורפולוגיה וההדמיה, של ליבת הגנטיקה המולקולרית (מחלקת עיניים ומדעים חזותיים) ושל עכבר הגנטיקה Core באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס בית הספר לרפואה. המחברים נתמכים על ידי תכנית המענק הקטנה ממרכז מקדונל לתאי ומולקולרית לנוירוביולוגיה, מרכז התקווה להפרעות נוירולוגיות, העין הלאומית (# R01EY022632 לDH), National Eye Institute מרכז Core גרנט (# P30EY002687) ו מענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון למחלקת עיניים ומדעים חזותיים.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
