細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証
Summary
Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.
Abstract
Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.
Introduction
核膜（NE）は、細胞質から核質を分離します。これは、核膜孔に接続し、内側と外側核膜（INMとそれぞれONM）で構成されています。両方の膜で区切らルーメンは核周辺領域（PNS）と呼ばれています。 ONMは、粗面小胞体（ER）を拡張したものであり、INMは核ラミナ、核A-で表さタイプ-Vの中間フィラメントおよびB型ラミン1,2の網目構造に準拠しています。細胞核の骨格と細胞骨格（LINC）複合体のリンカーは、物理的に細胞骨格フィラメントと分子モーター（ 図1A）に核の内部を接続するための全体の核エンベロープにまたがる高分子集合体です。日（SAD1 / Unc84）タンパク質とNesprins（核膜SPectRINS）：彼らは、NEの一体型膜貫通型タンパク質の2家族を特徴づける進化的に保存されたモチーフ間の相互作用で構成されています。哺乳類では、Sun1とSun2 ARN末端 核質地域INMの電子の膜貫通タンパク質は、A及びB型ラミン3-5と直接対話します。 INMの反対側には、PNS内、日タンパク質は、〜150のC末端アミノ酸の進化的に保存されたストレッチを抱い日ドメインと呼ばれます。日ドメインは、進化的に保存さKASH（Klarsicht / ANC-1、あれから相同性）ドメイン、Nesprinsの分子署名と直接対話。 KASHドメインは、膜貫通ドメイン6に続いて、PNS内に突出〜30のC末端アミノ酸のストレッチで構成されています。少なくとも4つの異なるNesprin遺伝子（Nesprin1-4）は、NE 7に局在KASH含有タンパク質をコードします。サイズ〜50kDa（Nesprin4）から驚くほどの千キロダルトン（Nesprin1巨人）に変わるNesprins、の細胞質領域は、複数のスペクトリンは、アクチン、プレクチンと分子モーター8のような細胞骨格成分との相互作用を可能にするだけでなく、特定のモチーフを繰り返し含ま13。
<脊椎動物と無脊椎動物のpクラス= "jove_content">研究は、ラミン/日/ Nesprin /分子モーターは、進化的に保存された「軸」の核移行と足場を制御を構成していることが示されています。 LINC複雑なコンポーネントのいくつかのノックアウト（KO）マウスモデルが記載され、哺乳類の発生9,14,15中のNEで太陽とNesprinタンパク質の役割を理解するためのフレームワークを提供することに尽力したされています。最も顕著なのが、本これらのモデルには、いくつかの重大な欠点、：細胞非自律的効果による表現型の解釈に1）困難、KASHレスNesprinは16アイソフォーム対KASH含有の表現型の貢献を区別するのに2）難易度、3）多数の細胞タイプで、NEで太陽とNesprinタンパク質の機能的冗長性は、両方のKASHドメインを欠損したマウス17内のすべてのSUN-KASH相互作用およびマウスの4）周産期致死性を不活性化するために、複雑な繁殖スキームが必要ですNesprins1と2は、大人の表現型18の分析を排除します。このプロトコルは、このように上記で概説した欠点の多くをバイパスして、細胞自律的かつ発生的に調節方法で、 生体内でのすべてのSUN-KASH相互作用を破壊するように設計された新規マウスモデルを記述しています。これのCre / LOXベースのマウスモデルは、2つの重要な概念に依存している：1）任意の公知Nesprinタンパク質のKASHドメインが細胞培養系内のNEにEGFPを標的とし、2）SUNドメインがの過剰発現、従って、KASHドメインと無差別に相互作用するのに十分です任意のKASHドメインは、すべての内因性日ドメインを飽和させ、ドミナントネガティブな方法17（ 図1B）にLINC複合体を不活性化します。このプロトコルは、小脳プルキンエ細胞内のすべてのSUN-KASHの相互作用の破壊を確認するために使用される組織の収穫と処理手順について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
正常のTg（CAG-のLacZ / EGFP-KASH2）モデルを用いてインビボで LINC複合体の役割を研究するための最も重要なステップは、適切なのCreマウス系統を同定することです。 Creが同様の経路に関与する他の細胞型で活性であれば確かに、それは結果の解釈を複雑にすることができます。小脳（ 図2B）の分子および顆粒細胞層にここに示されるように、したがって、それは、近隣…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、分子遺伝学のコア（眼科およびVisual科学科）の医学のセントルイス校のワシントン大学でマウス遺伝学コアの形態とイメージングコアのスタッフに、感謝します。作者は、携帯用のマクドネルセンター分子神経生物学、神経疾患のためのホープセンターから小規模助成プログラムでサポートされている、国立眼研究所（DHへ＃R01EY022632）、国立眼研究所センターコアグラント（＃1 P30EY002687）と眼科およびVisual科学科に失明を防止するための研究から無制限の助成金。
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
