Validation d'un modèle de souris de perturber CLIC complexes de façon spécifique à la cellule

Summary

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Abstract

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Introduction

L'enveloppe nucléaire (NE) sépare le nucléoplasme à partir du cytoplasme. Il est composé d'une membrane nucléaire interne et externe (INM et ONM, respectivement) qui se connectent à des pores nucléaires. La lumière délimitée par deux membranes est appelé l'espace périnucléaire (PNS). L'ONM est une extension du réticulum endoplasmique rugueux (ER) et l'INM adhère à la lamina nucléaire, un maillage de l'énergie nucléaire de type V filaments intermédiaires représenté par A et de type B lamines ^1,2. Lieurs du cytosquelette et Nucleoskeleton (CLIC) sont des assemblages macromoléculaires complexes qui couvrent l'ensemble de l'enveloppe nucléaire de se connecter physiquement à l'intérieur du noyau de filaments du cytosquelette et des moteurs moléculaires (Figure 1A). Ils se composent d'interactions entre les motifs conservés qui caractérisent l'évolution, deux familles de protéines transmembranaires intégrante du NE: Sun (SAD1 / Unc84) des protéines et des Nesprins (SPectRINS enveloppe nucléaire). Chez les mammifères, Sun1 et Sun2 are protéines transmembranaires de l'INM dont la région nucléoplasmique N-terminal interagit directement avec A et de type B lamines ^3-5. De l'autre côté de l'INM, dans le PNS, protéines Sun Harbor un tronçon évolutif conservé de ~ 150 acides aminés C-terminal appelé le domaine soleil. SUN domaines interagissent directement avec l'évolution conservé KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne homologie) domaine, la signature moléculaire de Nesprins. KASH domaines sont constitués par un tronçon de ~ 30 acides aminés C-terminal qui fait saillie dans le PNS suivi d'un domaine transmembranaire ^6. Au moins quatre gènes distincts (Nesprin1-4 Nesprin) codent KASH contenant des protéines qui localisent au NE ^7. Les régions cytoplasmiques de Nesprins, dont les tailles varient de ~ 50 kDa (Nesprin4) à une étonnante 1.000 kDa (Nesprin1 géant), contiennent spectrine multiples répétitions ainsi que des motifs spécifiques permettant leur interaction avec les composants du cytosquelette tels que l'actine, plectine et moteurs moléculaires ^{8- 13.}

<p class = "jove_content"> Études chez les vertébrés et les invertébrés ont montré que Lamin / moteurs moléculaires Sun / Nesprin / constituent un "axe" évolutif conservé le contrôle de la migration nucléaire et d'ancrage. Plusieurs modèles de souris knock-out (KO) de CLIC composants complexes ont été décrites et ont contribué à fournir un cadre pour comprendre le rôle des protéines Sun et Nesprin au cours du développement des mammifères NE ^9,14,15. Cependant, ces modèles présentent plusieurs inconvénients importants, et plus particulièrement: 1) difficulté à interpréter phénotypes dues à la cellule des effets non-autonomes, 2) la difficulté de distinguer les contributions phénotypiques de KASH contenant vs KASH-moins Nesprin isoformes ^16, 3) la redondance fonctionnelle des protéines Sun et Nesprin à la NE dans de nombreux types de cellules nécessite des programmes de sélection complexes pour inactiver toutes les interactions SUN-Kash chez la souris ^{17 et} 4) la létalité périnatale de souris déficientes pour le KASH-domaine à la foisNesprins1 et 2 se oppose à l'analyse des phénotypes adultes ^18.

Ce protocole décrit un nouveau modèle de souris conçu pour perturber toutes les interactions SUN-Kash in vivo, dans une cellule de façon autonome et régulée par le développement, contournant ainsi la plupart des inconvénients décrits ci-dessus. Ce modèle de souris Cre / sur la base de LOX-repose sur deux concepts importants: 1) le domaine KASH de toute protéine Nesprin connu est suffisante pour cibler EGFP vers NE dans les systèmes de culture de cellules et 2) les domaines de SUN interagir pêle-mêle avec des domaines KASH, ainsi surexpression de tout domaine KASH va saturer tous les domaines de SUN endogènes et inactiver complexes CLIC de manière dominante négative ¹⁷ (figure 1B). Ce protocole décrit la récolte des tissus et des étapes de traitement utilisées pour confirmer l'interruption de toutes les interactions SUN-Kash dans les cellules de Purkinje du cervelet.

Protocol

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université de Washington à St. Louis. 1. élevage de souris et de génotypage Race Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) souris avec Tg (PCP2-Cre) pour produire des souris Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Note: Alors que le reste de ce protocole met l'accent sur l'utilisation de …

Representative Results

Ce protocole illustre l'utilité de la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) Tg modèle de souris pour restreindre EGFP-KASH2 expression à l'aide de cellules cérébelleuses de Purkinje souris Tg (PCP2-Cre). Dans Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) progéniture, le cadre de lecture ouvert LacZ / V5 est excisée à P6 par la Cre recombinase ce qui conduit à l'expression de EGFP-KASH2 spécifiquement ciblées sur les cellules de Purkinje (figure 2A). Comme prévu, EGFP-KASH2 est destiné à l'env…

Discussion

L'étape la plus critique pour étudier avec succès le rôle de complexes CLIC in vivo utilise le (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modèle Tg est d'identifier une ligne appropriée de la souris Cre (s). En effet, si Cre est actif dans d'autres types cellulaires impliqués dans les voies similaires, il peut compliquer l'interprétation des résultats. Par conséquent, il est important d'examiner les cellules voisines, comme illustré ici dans les couches cellulaires et moléculaires granulaires du ce…

Materials

Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% Paraformaldehyde Solution	Electron Microscopy Sciences	15710
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Adhesion Slides	StatLab	M1000W
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Anti-Calbindin Antibody	Sigma Aldrich	C9848
Anti-EGFP Antibody	Abcam	ab13970
Anti-Nesprin2 Antibody			Previously described in Ref. 21
Fluorescent Mounting Media	Dako	S3023
2-methyl butane	Sigma Aldrich	O3551