एक माउस मॉडल के मान्यकरण एक सेल विशेष तरीके में LINC परिसर बाधित करने के लिए
Summary
Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.
Abstract
Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.
Introduction
परमाणु लिफाफा (पूर्वोत्तर) कोशिका द्रव्य से nucleoplasm अलग करती है। यह परमाणु pores, पर कनेक्ट है कि एक आंतरिक और बाहरी परमाणु झिल्ली (INM और क्रमशः onm,) से बना है। दोनों झिल्ली द्वारा चित्रित लुमेन perinuclear अंतरिक्ष (पीएन) कहा जाता है। Onm किसी न किसी जालिका (ईआर) का एक विस्तार है, और INM परमाणु पटल का पालन करता है, ए और बी प्रकार के प्रतिनिधित्व वाले परमाणु टाइप वी माध्यमिक तंतुओं का एक meshwork 1,2 lamins। Nucleoskeleton और cytoskeleton (LINC) परिसरों के Linkers शारीरिक रूप से cytoskeletal तंतु और आणविक मोटर्स (चित्रा 1 ए) के नाभिक के इंटीरियर से कनेक्ट करने के लिए पूरे परमाणु लिफाफा कि अवधि macromolecular विधानसभाओं हैं। सूर्य (Sad1 / Unc84) प्रोटीन और Nesprins (परमाणु लिफाफा SPectRINS): वे पूर्वोत्तर के अभिन्न transmembrane प्रोटीन के दो परिवारों की विशेषताएँ कि evolutionarily संरक्षित रूपांकनों के बीच बातचीत से मिलकर बनता है। स्तनधारियों में, Sun1 और Sun2 ए.आर.जिसका एन टर्मिनल nucleoplasmic क्षेत्र ए और बी प्रकार lamins 3-5 के साथ सीधे संपर्क INM की ई transmembrane प्रोटीन। पीएन भीतर INM के दूसरे पक्ष पर, सूर्य प्रोटीन 150 सी टर्मिनल अमीनो एसिड रवि डोमेन बुलाया ~ के एक विकासवादी-संरक्षित खिंचाव बंदरगाह। रवि डोमेन विकासवादी-संरक्षित KASH के साथ सीधे बातचीत (Klarsicht / Anc -1, उस वक़्त अनुरूपता) डोमेन, Nesprins की आणविक हस्ताक्षर। KASH डोमेन के एक transmembrane डोमेन 6 से पीछा पीएन में protrudes कि ~ 30 सी टर्मिनल अमीनो एसिड के एक खंड से मिलकर बनता है। कम से कम चार अलग Nesprin जीन (Nesprin1-4) पूर्वोत्तर 7 बजे स्थानीय बनाना प्रोटीन है कि KASH युक्त सांकेतिक शब्दों में बदलना। एक आश्चर्यजनक 1,000 केडीए (Nesprin1 विशाल) जिसका आकार बदलती ~ 50kDa (Nesprin4) से Nesprins, के cytoplasmic क्षेत्रों, कई spectrin ऐसे actin, plectin और आणविक मोटर्स 8 के रूप में cytoskeletal घटकों के साथ उनकी बातचीत को सक्षम करने को दोहराता है और साथ ही विशिष्ट रूपांकनों शामिल 13।
<रीढ़ और अकशेरूकीय में पी वर्ग = "jove_content"> अध्ययन Lamin / सूर्य / Nesprin / आणविक मोटर्स एक evolutionarily संरक्षित 'धुरी' परमाणु प्रवास और लंगर को नियंत्रित करने का गठन कर दिखाया है। LINC जटिल घटकों के कई नाकआउट (को) माउस मॉडल का वर्णन किया और स्तनधारी विकास 9,14,15 दौरान पूर्वोत्तर में सूर्य और Nesprin प्रोटीन की भूमिका को समझने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी गया है। हालांकि, इन मॉडलों सबसे विशेष रूप से उपस्थित कई महत्वपूर्ण कमियां: के phenotypical योगदान भेद में गैर स्वायत्त प्रभाव, 2) कठिनाई सेल के कारण phenotypes की व्याख्या में 1) कठिनाई KASH-कम Nesprin बनाम KASH युक्त, 3) 16 isoforms कई प्रकार की कोशिकाओं में पूर्वोत्तर में सूर्य और Nesprin प्रोटीन के कार्यात्मक अतिरेक दोनों की KASH-डोमेन के लिए चूहों की कमी 17 में सभी सूर्य-KASH बातचीत और चूहों के 4) प्रसवकालीन मारक निष्क्रिय करने के लिए जटिल प्रजनन योजनाओं की आवश्यकता हैNesprins1 और 2 वयस्क के विश्लेषण 18 phenotypes अलग करता है।इस प्रोटोकॉल इस प्रकार ऊपर उल्लिखित कमियों के कई दरकिनार, एक सेल स्वायत्त और विकासात्मक विनियमित तरीके से विवो में सभी सूर्य-KASH बातचीत को बाधित करने के लिए बनाया गया एक उपन्यास माउस मॉडल, का वर्णन है। इस Cre / lox आधारित माउस मॉडल दो महत्वपूर्ण अवधारणाओं पर निर्भर करता है: 1) किसी भी ज्ञात Nesprin प्रोटीन की KASH डोमेन सेल संस्कृति प्रणालियों में पूर्वोत्तर के लिए EGFP को निशाना बनाने और 2) सूर्य डोमेन की overexpression इस प्रकार, KASH डोमेन के साथ मिश्रित होकर बातचीत करने के लिए पर्याप्त है किसी भी KASH डोमेन सभी अंतर्जात रवि डोमेन तर और एक प्रमुख नकारात्मक तरीके से 17 (चित्रा 1 बी) में LINC परिसरों को निष्क्रिय करेगा। इस प्रोटोकॉल ऊतक कटाई और अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं में सभी सूर्य-KASH बातचीत के विघटन पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है प्रसंस्करण कदम का वर्णन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सबसे महत्वपूर्ण कदम सफलतापूर्वक टीजी (सीएजी lacZ / EGFP-KASH2) मॉडल एक उपयुक्त Cre माउस लाइन (एस) की पहचान करने के लिए है का उपयोग vivo में LINC परिसरों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए। Cre समान रास्ते में शामिल अन्य सेल-प…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों (विभाग नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान) और मेडिसिन के सेंट लुइस स्कूल में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में माउस आनुवंशिकी कोर के आणविक आनुवंशिकी कोर की, आकृति विज्ञान और इमेजिंग कोर के कर्मचारियों को धन्यवाद। लेखकों सेलुलर के लिए मैकडोनल केंद्र और आण्विक तंत्रिका जीव विज्ञान, मस्तिष्क संबंधी विकार के लिए आशा है कि केंद्र से छोटे अनुदान कार्यक्रम के द्वारा समर्थित हैं, राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (डीएच करने के लिए # R01EY022632), एक राष्ट्रीय नेत्र संस्थान केंद्र कोर अनुदान (# P30EY002687) और एक रिसर्च से अप्रतिबंधित अनुदान नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान विभाग को अंधापन रोकने के लिए।
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
References
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
