घाव स्क्रैच परख का अनुकूलन घुलनशील सिगरेट के धुएं निकालें द्वारा क्षति के बाद Murine Mesenchymal stromal सेल प्रवासन में परिवर्तन का पता लगाने के लिए
Summary
The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.
Abstract
Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.
Introduction
सेल प्रवास ऐसी ऊतक विकास, मरम्मत और उत्थान, साथ ही इस तरह के कैंसर मेटास्टेसिस और धमनीकाठिन्य 1 के रूप में रोग प्रक्रियाओं के रूप में कई शारीरिक प्रक्रियाओं को अत्यधिक समन्वित और महत्वपूर्ण है। सेल प्रवास की समझ क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत और कोशिका प्रत्यारोपण प्रौद्योगिकियों और कृत्रिम ऊतक 2 ग्राफ्टिंग सहित रोग की स्थिति, इलाज के लिए इस्तेमाल उभरते उपचार के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है। , ऊतकों की मरम्मत 3 मध्यस्थता कड़ाई से, मात्रात्मक अनुकूलनीय, और लागत प्रभावी ब्याज की बात यह है कि एक परख का उपयोग कर इन कोशिकाओं के प्रवासी क्षमता बढ़ाता में mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) की भूमिका में मौजूदा ब्याज को देखते हुए। महत्वपूर्ण बात है, इस तरह के एक परख क्षति के बाद सेलुलर प्रवासी क्षमता में अपेक्षाकृत सूक्ष्म परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील होना चाहिए। खरोंच assays, ट्रांस-अच्छी तरह से पलायन assays, सेल प्रवास बढ़ाता सहित के लिए मौजूदा तरीकों (Boyden चर्चाAmbers), micropillar सरणियों, और सेल अपवर्जन क्षेत्र assays के reproducibility, customizability, मात्रा का ठहराव, और लागत प्रभावशीलता 1,4,5 में सीमाओं की एक सीमा होती है। यहाँ वर्णित अनुकूलित खरोंच परख मजबूत परिणामों, मात्रात्मक और छवि के आधार पर विश्लेषण क्षमताओं, लागत प्रभावशीलता, और अन्य अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलन क्षमता को दर्शाता है।
स्क्रैच assays के विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों 5 के तहत सेल प्रवास और प्रसार का आकलन करने के लिए कई क्षमताओं में इस्तेमाल किया गया है। परख या पास संगम को पूरा करने के लिए उन्हें बढ़ रही है, नामित कोशिकाओं बोने, और एक बाँझ सुई या pipet टिप 6 के साथ परिणामी monolayer scratching पर जोर देता। विश्लेषण सबसे आम तौर पर बेतरतीब ढंग से चयनित स्थानों 7-9 पर कई बार अंक से अधिक खरोंच की चौड़ाई की तुलना द्वारा किया जाता है। इसकी प्रमुख उपयोग के बावजूद, खरोंच परख reproducibility और मात्रा का ठहराव के साथ मुद्दों से चकित है। में परिवर्तनशीलताखरोंच की पीढ़ी न केवल कोशिकाओं के microenvironment को बदल देता है, लेकिन यह भी प्लेट की सतह और अंतर्निहित कोशिकी मैट्रिक्स 5 को नुकसान पहुँचाए से सेल प्रवास बाधित कर सकते हैं। Assays अक्सर हालांकि धीमी प्रवास और अब परख बार प्रदर्शित सेल लाइनों के लिए, 12 घंटा के लिए 7 पर आयोजित कर रहे हैं, प्रसार एक confounding चर 7,10 हो जाता है। अन्त में, scratching प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं monolayer 1 में अंतर को बंद करने के लिए आवश्यक बाह्य संकेतन के साथ हस्तक्षेप करने वाले कारकों में जारी कर सकते हैं। खरोंच परख अनुकूलन परख समय की लंबाई को कम करने, और हेरफेर के दौरान अवांछित कोशिका मृत्यु को रोकने, सतह के गुणों के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि एक सुसंगत अंतराल के सृजन की आवश्यकता है। डाट आधारित परख के लिए एक सेल अपवर्जन क्षेत्र परख के एक अनुकूलन है। इस परख सेल के विकास को शामिल नहीं है कि अच्छी तरह से के बीच में रखा एक डाट इस्तेमाल करता है, लेकिन कोशिकाओं केंद्रीय अपवर्जन क्षेत्र के आसपास चढ़ाया जा करने के लिए अनुमति देता है।पलायन का आकलन करने के लिए, डाट निकाल दिया जाता है, और उसके एवज में अपवर्जन क्षेत्र पलायन घटित करने के लिए एक सतह प्रदान करता है। हालांकि, इस परख अनुकूलित या 10 अनुकूल करने के लिए मुश्किल होता है और कुछ अनुप्रयोगों के लिए, इस तकनीक को भी अत्यधिक लागत हो सकता है।
खरोंच assays और उनके डेरिवेटिव, ट्रांस-अच्छी तरह से पलायन assays के (या Boyden कक्ष assays) के विपरीत कीमोटैक्टिक एजेंटों 8,11 युक्त एक कक्ष में, एक microporous फिल्टर झिल्ली के माध्यम से, एक कक्ष से कदम है कि कोशिकाओं की संख्या बढ़ाता द्वारा पलायन का आकलन, 12। झरझरा झिल्ली के माध्यम से पलायन के बाद, कोशिकाओं कीमोटैक्टिक एजेंटों के संपर्क झिल्ली पक्ष का पालन करना, और सही ढंग से यों के लिए मुश्किल हो सकता है, क्योंकि इस तकनीक MSCs तरह पक्षपाती कोशिकाओं के लिए उपयोगिता सीमित है। परख कुछ तीन आयामी प्रवास पैटर्न की जांच करने में सक्षम है, वहीं प्रतिबंधित प्रकार की कोशिकाओं, जिसके लिए यह सही सेल प्रवास की सीमा इसकी उपयोगिता यों करने में सक्षम है 10। खरोंच assays के लिए एक अन्य विकल्प ख़राब करना और एक किराए के रूप सरणी में विस्थापित करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का उपयोग कर एक तीन आयामी अंतरिक्ष के माध्यम से सेलुलर गतिशीलता उपाय जो एक माइक्रो-स्तंभ सरणी का उपयोग करता है। Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomers एक सटीक मोल्ड पर ठीक हो और ओजोन के साथ इलाज किया और फ़ाइब्रोनेक्टिन एक समरूप और गैर degradable microenvironment पैदा करता है। सरणी 4 दर्ज करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता आंकने के लिए जरूरत के रूप माइक्रो-स्तंभ रिक्ति भी अलग किया जा सकता है। ढालना उच्च पहलू अनुपात सरणी 13 की नकारात्मक संस्करण बनाने के लिए सिलिकॉन वेफर्स के गहरे प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी के माध्यम से बनाई गई है। परख अपनी customizability से मजबूत है, वहीं क्षमता पलायन कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य के माध्यम से तीन आयामी प्रवास, और विश्लेषण करने के लिए मॉडल, माइक्रो-स्तंभ सरणियों बनाने में कठिनाई आर्थिक रूप से इसकी व्यापक उपयोग में बाधा उत्पन्न करती।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित अनुकूलित खरोंच परख एक कुशल, क्योंकि प्रदान करता हैस्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है कि लगातार खरोंच के उत्पादन के लिए टी-प्रभावी तरीका। इसके बजाय पहले और सेल प्रवास के बाद खरोंच भर में किए गए सरल चौड़ाई माप की, सॉफ्टवेयर से पहले और प्रवास के बाद कुल खरोंच क्षेत्रों का निर्धारण करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है। यह उन्नति जहां चौड़ाई माप लिया जाना चाहिए खरोंच निर्धारित करने की कोशिश करने के मुद्दे को सीमित करता है, और खरोंच की चौड़ाई कि क्या यह लंबाई के साथ एक समान है। इसके अलावा, सेल नंबर, सेल संगम और प्रकार और कोशिकाओं को दिए गए नुकसान की डिग्री से सावधान अनुकूलन आगे परख का अनुकूलन करने के क्रम में चर्चा की है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल प्रदर्शन और खरोंच assays के विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक मजबूत, मानकीकृत तरीका प्रदान करता है। सरल खरोंच assays नियमित तौर पर सेलुलर प्रवास जांच करने के लिए अध्ययन के कई अलग अलग क्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.
Materials
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healting plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
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