Abstract
El inmunofenotipo de sangre periférica por citometría de flujo determina los cambios en el estado de la frecuencia y la activación de los leucocitos periféricos durante enfermedad y el tratamiento. Tiene el potencial para predecir la eficacia terapéutica e identificar nuevas dianas terapéuticas. tinción de sangre entera utiliza la sangre no manipulada, lo que minimiza los artefactos que pueden ocurrir durante la preparación de la muestra. Sin embargo, toda la tinción de sangre también se debe realizar en la sangre recién recogida para asegurar la integridad de la muestra. Además, lo mejor es preparar los cócteles de anticuerpos en el mismo día para evitar la posible inestabilidad del tándem de colorantes y evitar la interacción entre el reactivo de tintes violetas brillantes. Por lo tanto, toda manchas de sangre requiere una cuidadosa estandarización para controlar la variabilidad intra e inter-experimental.
Aquí, se presenta la implementación de un manipulador de líquidos automatizado equipado con un (2D) lector de código de barras de dos dimensiones en un proceso estándar de hacer antibodY cócteles para citometría de flujo. Los anticuerpos se transfirieron a tubos de código de barras 2D dispuestos en un formato de 96 pocillos y sus contenidos en una base de datos compilada. El manipulador de líquidos podría entonces localizar los viales de anticuerpos fuente haciendo referencia a nombres de anticuerpos dentro de la base de datos. Nuestro método elimina la coordinación tedioso para el posicionamiento de los tubos de anticuerpos de origen. Proporcionó versatilidad permite al usuario cambiar fácilmente cualquier número de detalles en el proceso de dispensación de anticuerpo tal como un anticuerpo específico de usar, el volumen, y de destino mediante la modificación de la base de datos sin volver a escribir las secuencias de comandos en el método de software para cada ensayo.
Un experimento de prueba de concepto alcanza la precisión del análisis inter e intra excepcional, demostrado por la preparación de una réplica de 11 colores, flujo 17-anticuerpo ensayo de citometría. Estas metodologías se incrementaron el rendimiento global para citometría de flujo ensayos y facilitaron la preparación diaria de los cócteles de anticuerpos complejos requeridos para el fenotipo detalladaCaracterización typic de sangre periférica anticoagulada recién recogida.
Introduction
Fenotipo inmune de la sangre periférica humana determina los cambios cuantitativos y cualitativos en subconjuntos de células inmunes 1. Proporciona información sobre los mecanismos de acción y resistencia, el descubrimiento de biomarcadores predictivos ayudas, y facilita el desarrollo de inmunoterapias combinación. Por lo tanto, la validación y estandarización de immunophenotyping es un área de gran interés para los investigadores académicos, laboratorios clínicos, y las industrias.
Aunque inmunofenotipo de sangre periférica mediante métodos de citometría de flujo se utiliza actualmente para la gestión clínica de los tumores malignos hematológicos 2,3 y virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), 4,5 inmunofenotipo fiable de la sangre periférica para las demandas de inmunoterapia consideraciones específicas en la validación y estandarización porque requiere una cobertura más amplia sobre subconjuntos de células inmunes y / receptores inhibidores de activación 1,6-8. succeimmunophenotyping ssful requiere la estandarización cuidadosa para minimizar la variabilidad-experimento a experimento relacionado con la configuración del instrumento y el procedimiento de tinción de células 9,10. Mientras que la normalización de los ajustes del instrumento para citometría de flujo está bien establecido para hacer frente a la antigua preocupación 9,11,12, no queda claro cómo minimizar la variabilidad relacionada con la tinción de células sin restringir la cobertura de subconjuntos de células inmunes y su estado de activación.
Como el número de antígenos a detectar aumenta, también lo hace la posibilidad de error y la variabilidad debido a la dispensación de reactivo subóptima y la contaminación cruzada. Métodos para el análisis phenoptypic de sangre entera anticoagulada se establecieron en la década de 1980 para su uso en ensayos de laboratorio clínico. Estos mismos métodos satisfacen las necesidades de los laboratorios de investigación para la preparación de la muestra. Es importante destacar que los cócteles de anticuerpos utilizados en el laboratorio clínico son típicamente menos complejo y available pre-tituló y se pre-mezclado del fabricante. Sólo se requiere una única transferencia de la mezcla de anticuerpos pre-mezclado. En el marco de la investigación, los cócteles de anticuerpos de 10-16 anticuerpos son típicos. Cada cóctel debe ser validado por la estabilidad por el laboratorio o preparado fresco antes de cada ensayo. Preparación de múltiples mezclas de anticuerpos para una muestra podría comportar el pipeteo de 50-80 anticuerpos individuales, una tarea que es tedioso y propenso a errores.
La automatización de la preparación de cócteles tiene varias ventajas sobre la preparación de cócteles manual, tal como menos errores, mayor precisión de pipeteo, y posiblemente incluso la disminución del desperdicio de reactivo. Aquí, se presenta la introducción exitosa de un manipulador de líquidos automatizado equipado con un (2D) lector de código de barras de dos dimensiones en el proceso de tinción celular de immunophenotyping para minimizar la variabilidad relacionada con la preparación de la muestra.
Protocol
Obtención y utilización de la sangre periférica en este protocolo fue aprobado por el Providence Health & Services Junta de Revisión Institucional. Todos los seres humanos siempre que su consentimiento informado por escrito.
Nota: Siga las precauciones universales. Toda la sangre humana deben ser tratados como si fueran infecciosas y manipula de acuerdo con las prácticas de bioseguridad de nivel 2.
Nota: Inmunofenotipificación con sangre entera periférica se realiza incubando la sangre total anticoagulada con anticuerpos monoclonales fluorescentes de etiquetado para detectar antígenos de la superficie celular, seguido por lisis hipotónica para eliminar las células rojas de la sangre. Se lavan las células y la muestra se analiza mediante un citómetro de flujo. El método descrito en este documento se centra en la preparación de los cócteles de anticuerpos utilizando el manipulador de líquidos automatizado equipado con un lector de código de barras 2D. En primer lugar, el "Cocktail Base" que identifica subconjuntos de células inmunes y el "Cóctel de activación" que monitorea iantígenos nducible se preparan por separado (Tabla 1). A continuación, los dos cócteles se mezclan para crear un "Cocktail Master Anticuerpo". Véase la Figura 1 para el flujo de trabajo.
1. Espécimen
- Recoger la sangre periférica mediante punción venosa en un tubo de recogida de sangre anticoagulada con heparina sódica, invierta suavemente varias veces para asegurar una mezcla adecuada, y luego mantenga a la temperatura ambiente. Rechazar espécimen si coagulada o hemolizada 13.
2. Los aparatos de laboratorio Preparación
- Etiqueta de código de barras 2D tubos con etiquetas legibles (nombre anticuerpo, vendedor, número de catálogo, y el número de lote).
- Transferir totalidad del contenido de los viales de anticuerpos del vendedor (que se enumeran en la Tabla 1) a los correspondientes tubos de códigos de barras 2D.
Nota: Tenga extremo cuidado para no introducir burbujas en forma de burbujas falsamente desencadenar detección de nivel de líquido (LLS) que da lugar a la transferencia subóptima de reactivo.
Nota: Asegúrese de que cada anticuerpo viAl tiene suficientes anticuerpos para la carrera. - Leer el código de barras 2D para cada tubo por el lector de código de barras 2D.
- Hacer una hoja de cálculo que contiene los nombres de anticuerpos (AB) y código de barras lee (BC) utilizando un software de hoja de cálculo y guardarla en un archivo de valores separados por comas (CSV) como "AB_BC.csv" (Tabla 2).
Nota: Asegúrese de formatear las células como "texto" no "Número" con el fin de mantener el primer "0" para los números de código de barras en su caso (por ejemplo, 0163562544). Añadir "x, 0000000000" al final para especificar final de los datos. - placas de metal tornillo de LLS en el marco de la cubierta de la curva de líquido automatizado para permitir LLS.
3. Programación para la Automatizado Liquid Handler
Nota: Dos métodos se pueden programar en el software para el manipulador de líquidos automatizado: a) un método para hacer "Cocktail Base" y "Cocktail de activación" en 3.1), y b) un método para la fabricación de "Master AntiboCóctel dy "mediante la combinación de la" Base de cóctel "y" Cocktail de activación "en el punto 3.2) (Figura 1).
- Crear un método para hacer el "Cocktail Base" y "Cocktail de activación" (Figura 2).
- Utilizando el software de hoja de cálculo, hacer una hoja de cálculo que contiene información para los nombres de anticuerpos (AB_NAME), la ubicación del tubo de destino (BIEN-BASE o BIEN-ACT) y el volumen (VOL) en l para "Cóctel de base" con puntas P50 (BASE_CT_P50: Tabla 3) o consejos P200 (BASE_CT_P200: Tabla 4) y "Cocktail de activación" con puntas P50 (ACT_CT_P50: Tabla 5) o consejos P200 (ACT_CT_P200: Tabla 6). Guardarlos como archivos CSV. Por "BIEN-BASE" y la ubicación "BIEN-ACT", se refieren a los números en la figura 3.
Nota: VOL = título de x (# de + 2 tinción) l. Los títulos de la Tabla 1 son lote específico. El operador debe determinar una tetaer para cada anticuerpo como se ha descrito por otros 14. - Haga clic en un icono para iniciar el software para el manipulador de líquidos automatizado en el equipo para crear un método para la fabricación de "Cocktail Base" y "Cocktail de activación".
Nota: Los siguientes pasos 3.1.3-3.1.7 definirán el material de laboratorio: el bastidor de tubo con los tubos de códigos de barras 2D (Figura 4). Las mediciones se proporcionan como referencia. Los investigadores deben determinar y ajustar para cada instrumento. - En la barra de herramientas en "Proyecto", seleccione "Los aparatos de laboratorio Tipo Editor". Haga clic en un objeto para un plato plano de 96 pocillos, seleccione "Copiar" y tipo "Matrix_OneML_TubeRack" en una ventana emergente.
- Haga doble clic en el objeto "Matrix_OneML_TubeRack" para abrir el cuadro de diálogo. Marque la opción "Información básica", estableció 12.775 cm (X) y 8.546 cm (Y) para "Span" y 4,625 cm para "Altura". (Figura 4A).
- A continuación, resalte "MovemInformación ent ". Fije la pinza desplazamiento 0 (X), 0 (Y), y 0,3 (Z), Pinza Squeeze -0.1cm, Pinza Unsqueeze 2,6 cm, límite de velocidad de 75%, y luego marque" Use el sensor de pinza "(figura 4B).
- A continuación, resalte "Well_1". Ajuste de la siguiente manera: "Bueno Offset"; 1,5 cm (X) y 1,13 cm (Y), "Bueno Count"; 12 (X) y 8 (Y), "espaciamiento del pozo"; 0.9 (X) y 0.9 (Y), "Volumen máximo"; 1.500 l, Formato "; regular," Colum 2 Offset "; 0, y" volumen predeterminado "; 0 (Figura 4C).
- Por último, pulse un botón "Editar ..." a la derecha de "Configuración del Bien" (Figura 4C). En una ventana emergente, establecido de la siguiente manera: "Forma"; Ronda, "Alta Radio"; 0.37 cm, "Baja Radius"; 0.37 cm, y "Altura"; 3,9 cm. Marque "Sección Inferior" y ajuste "Shape"; Cone, "Radio"; 0.37 cm, y "Altura"; 0,4 cm (Figura 4D).
Nota: Los siguientes pasos 3.1.8-3.1.11 definirán el material de laboratorio: el bastidor tubo con tubos de microcentrífuga. Las mediciones se proporcionan como referencia. Los investigadores deben determinar y ajustar para cada instrumento. - En la barra de herramientas en "Proyecto", seleccione "Los aparatos de laboratorio Tipo Editor". Haga clic en un objeto para un rack de 24 posiciones, seleccione "SmallTuberack_microfugetubes", "Copiar" y tipo.
- Haga doble clic en el "SmallTuberack_microfugetubes" objeto para abrir el cuadro de diálogo. Marque la opción "Información básica", establece 12,75 cm (X) y 8,5 cm (Y) para "Span" y 3,95 cm para "Altura".
- A continuación, resalte "Well_1". Ajuste de la siguiente manera: "Bueno Offset"; 1.621 cm (X) y 1.181 cm (Y), "Bueno Count"; 6 (X) y 4 (Y), "espaciamiento del pozo"; 1.9 (X) y 1.9 (Y), "Volumen máximo"; 1.000 l, Formato "; regular," Colum 2 Offset "; 0, y" volumen predeterminado "; 0.
- Por último, pulseun "Editar ..." botón situado a la derecha de "Configuración Bien". En una ventana emergente, establecido de la siguiente manera: "Forma"; Ronda, "Alta Radio"; 0,3345 cm, "Baja Radius"; 0,274 cm, y "Altura"; 3.6728 cm. Marque "Sección Inferior" y ajuste "Shape"; Hemisferio, y "Radio"; 0.1575 cm.
Nota: Los siguientes pasos 3.1.12-3.1.35 explicarán cómo programar el "nuevo método" para hacer el "Cocktail Base" y "Cocktail de activación" (Figura 2). - Haga clic en el icono "Nuevo Método" y abierto.
- Arrastrar un icono "SI" entre una y el icono "Inicio" en "Finalizar" en el nuevo método (Figura 2). Haga clic y resalte el icono "SI". Escriba lo siguiente para Condición:. CreateObject ( "World.EngineObject") simulando
Nota: Esto evitará que el software desde la revisión de errores y permitir que este método funcione. Sin este paso, los software alertará información que falta para el conjunto de datos como código de barras lee sólo están disponibles después de la etapa "VisionMate: Leer códigos de barras" se describe en 3.1.20). Desde este paso se desactiva la etapa de verificación en el software, el operador debe confirmar que no hay suficientes consejos y reactivo en la cubierta para llevar a cabo este método. - Inserte un icono "Configuración del instrumento" entre el icono "Entonces", y el primer icono "Fin" en el icono "SI" (Figura 2).
Nota: Para todos los pasos siguientes, iconos de arrastre entre el icono "Else" y el segundo icono de "Fin" bajo el icono "SI", por lo que los pasos están encapsulados en el "otro sitio". - Arrastre el icono de "Configuración del instrumento" debajo del icono "Else" en el método (Figura 2).
- Haga clic en el icono de "Configuración del instrumento" en el método para abrir la ventana. Configurar labwares arrastrando iconos para P50 LLS filtrados consejos, consejos P200 LLS filtrados, P1000 consejos, "Matrix_OneML_TubeRack", dos "SmallTuberack_microfugetubes", y el depósito a la posición de cubierta correspondiente de la lista de iconos.
- Abrir el cuadro de diálogo para la "Matrix_OneML_TubeRack" y el nombre como "AB_BOX". Abrir el cuadro de diálogo para los "SmallTuberack_microfugetubes" y nombrar a uno como "BASE_CT" para los cócteles base y el otro como "ACT_CT" para la activación Cócteles (Figura 5).
- Arrastre un icono "Transfer" al método (Figura 2) para agregar un paso para la transferencia de búfer desde el depósito en tubos de microcentrífuga para "Cóctel de Base" y "Cocktail de activación". volumen de transferencia = 25 l x (# 2 de tinción) para "Cóctel de Base" y = 25 x l (# 2 de tinción) para "Cóctel de activación".
- Añadir pasos para mover el "Matrix_OneML_TubeRack" en el lector de código de barras 2D. Arrastre un icono "VisionMate Move" con el método (Figura 2) y especificar el movimiento desde la posición inicial hasta la cubierta de la posición del lector de código de barras en la cubierta.
- Arrastre un "VisionMate: Leer códigos de barras" icono para el método (Figura 2). Abrir el cuadro de diálogo y seleccione "VisionMate" como el dispositivo y el nombre del conjunto de datos como "BC_Read".
- Arrastre una "pausa de usuario" (Figura 2), seleccione "Detener todo el sistema y mostrar este mensaje" y escriba un comentario en el campo para recordar a los usuarios de la inclusión de todos los códigos de barras se leen antes de proceder al siguiente paso.
Nota: Los siguientes pasos 3.1.22-3.1.26 enlazarán entre localizaciones de pozos y nombres de anticuerpos por medio de la información del código de barras. Esto permitirá que el manipulador de líquidos automatizado para encontrar una localización del anticuerpo en particular basándose en el nombre de anticuerpos "AB". - Arrastre un icono "Reporte Paso" con el método (Figura 2).
- Hacer un archivo de texto utilizando un programa de texto y guardarlocomo "BC_Readout" en la carpeta de documentos en el ordenador.
- Abrir el cuadro de diálogo para la "Presentación de informes Paso", "Archivo de texto" para el estilo de informe y seleccione el archivo "BC_Readout" a través de la navegación.
Nota: El archivo "BC_Readout" resultante contendrá información para todos los labwares en la cubierta excepto consejos como se configura en 3.1.16 incluyendo la información de código de barras lee para tubos de códigos de barras 2D y lugares así en el "Matrix_OneML_TubeRack". - Añadir un "Crear conjunto de datos" paso para enlazar código de barras y la información también. Arrastrar el icono "Crear conjunto de datos" con el método (Figura 2), haga clic en él para abrir el cuadro de diálogo, seleccione "Leer de un archivo" y seleccione "AB_BC.csv" (Tabla 2 creada en 2.4), marque "comas delimitada "y" El archivo tiene una fila de cabecera ".
Nota: En la ventana de previsualización de archivos, nombres de anticuerpos (AB) y código de barras lee (BC) debe ser visto. - En la Scuadro de diálogo para la AME "Crear conjunto de datos" en la 3.1.25, seleccione "VM1" para la ubicación de material de laboratorio y "0" para la profundidad de la pila, seleccione "coincidir con el ID de muestra", y utilice el campo "BC" para que coincida con los Datos Ajuste "BC_Read". Seleccione "AB" y "AC" para "conjuntos de datos que se creen" (Figura 6).
- Arrastre un icono "VisionMate Move" con el método (Figura 2) y especificar el movimiento desde la posición de lector de código de barras "VM1" de nuevo a la posición inicial de la cubierta en la cubierta.
Nota: Los siguientes pasos 3.1.28-3.1.33 definirán etapa de transferencia para "Cóctel de base". - Arrastre un icono de la "Lista de trabajo" (Figura 2) y busque y seleccione el archivo de lista de trabajo "Base_CT_P50" (Tabla 3), creado en el punto 3.1.1. Marque "toda Loop lista de trabajo".
- Arrastrar el icono "Transfer" directamente debajo del icono "Lista de trabajo" (Figura 2). </ Li>
- Haga clic en el icono "Transfer" para abrir el campo de especificación. Seleccione una de las sondas, P50 LLS consejos filtrados, seleccione "descargarlos" cuando la transferencia se realiza, y comprobar "Cambie las puntas entre las transferencias". Añadir origen haciendo clic en "Haga clic aquí para añadir una fuente", seleccione "Matrix_OneML_TubeRack" como material de laboratorio, y seleccione la ubicación en la cubierta por su nombre "AB_BOX".
- En el campo de especificación para la "transferencia", "Zoom" en el diagrama de 96 pozos con un clic derecho y elija "AB" inmediatamente después "Uso conjunto de datos" y seleccione donde sus valores "son iguales a" y "= AB_NAME" . Seleccione técnica de transferencia de la opción.
Nota: El uso de LLS es muy recomendable para evitar que los desechos se precipitó cerca del fondo. - En el campo de especificación para la "transferencia", seleccione el destino haciendo clic en "Haga clic aquí para añadir un destino", haga clic derecho para acercar y seleccione "SmallTuberack_microfugetubes "como material de laboratorio, el volumen como" = VOL ", y la ubicación en la cubierta por su nombre" BASE_CT ". Después de reducir el zoom, haga clic de nuevo, marque" Especificar selección como texto ", y marca" Especificar los objetivos con la expresión a continuación: "y tipo" = WELL_BASE "como una variable para una posición cubierta destinación.
- Repita 3.1.29-3.1.32 de manera similar para "Cóctel de base" con puntas P200, seleccionando el archivo csv "Base_CT_P200" (Tabla 4) y luego elegir P200 LLS consejos, así como la técnica de la pipeta adecuada filtrados para P200 LLS consejos filtrados.
Nota: Los siguientes pasos 3.1.34 y 3.1.35 definirá etapa de transferencia para "Cóctel de activación". - Repita 3.1.29-3.1.32 de manera similar para "Cóctel de activación" con puntas P50, seleccionando el archivo csv "ACT_CT_P50" (Tabla 5) y eligiendo "ACT_CT" como destino. Haga clic derecho sobre el destino y marca "Especificar selección como texto";. Marque "Especificar los objetivos con la siguiente expresión:" y tipo "= WELL_ACT" como una variable para un puesto de destino.
- 3.1.34 Repetir lo mismo para "Cóctel de activación" con puntas P200, seleccionando el archivo csv "ACT_CT_P200" (Tabla 6) y consejos P200 LLS filtrados.
Nota: El método para la fabricación de "Cocktail Base" y "Cocktail de activación" se puede cerrar después de guardar.
- Utilizando el software de hoja de cálculo, hacer una hoja de cálculo que contiene información para los nombres de anticuerpos (AB_NAME), la ubicación del tubo de destino (BIEN-BASE o BIEN-ACT) y el volumen (VOL) en l para "Cóctel de base" con puntas P50 (BASE_CT_P50: Tabla 3) o consejos P200 (BASE_CT_P200: Tabla 4) y "Cocktail de activación" con puntas P50 (ACT_CT_P50: Tabla 5) o consejos P200 (ACT_CT_P200: Tabla 6). Guardarlos como archivos CSV. Por "BIEN-BASE" y la ubicación "BIEN-ACT", se refieren a los números en la figura 3.
- Crear un nuevo método para la fabricación de "Maestro de anticuerpos Cocktail" mediante la combinación de "Cocktail Base" y "Cocktail de activación" en 5 ml de tubos de poliestireno de fondo redondo (Figura 7).
Nota: Los siguientes pasos 3.2.1-3.2.6 definirán el material de laboratorio: el soporte de tubos de 5 ml con tubos de poliestireno de fondo redondo. Los números se proporcionan como referencia. Los investigadores deben determinar y ajustar para el instrumento.- En la barra de herramientas en "Proyecto", seleccione "Los aparatos de laboratorio Tipo Editor". Haga click en un objeto para el rack de 24 posiciones, seleccione "Copiar" y escriba "BiocisionCoolRack_XT" en una ventana emergente.
- Haga doble clic en el objeto "BiocisionCoolRack_XT" para abrir el cuadro de diálogo.
- Marque la opción "Información básica", establece 12,78 cm (X) y 8,57 cm (Y) para "Span" y 7,93 cm para "Altura".
- Resaltar "Well_1". Ajuste de la siguiente manera: "Bueno Offset"; 1.55 cm (X) y 1,33 cm (Y), "Bueno Count"; 6 (X) y 4 (Y), "espaciamiento del pozo"; 1,95 (X) y 1,97 (Y), "Volumen máximo"; 2.000 l, Formato "; regular," Colum 2 Offset "; 0, y" volumen predeterminado "; 0.
- Abrir "Configuración Bien" para editar. Ajuste de la siguiente manera: "forma"; Ronda, "Alta Radio"; 0.5375 cm, "Baja Radius"; 0,48 cm, y "Altura"; 7.07 cm. Marque "Sección Inferior" y ajuste "Shape"; Hemisferio, y "Radio"; 0,45 cm.
Nota: Los siguientes pasos3.2.6-3.2.7 definirá pasos de transferencia y ser usado en el paso 3.2.14. - Crear un archivo csv "AB_MACT" (Tabla 7) para la toma de cóctel de anticuerpos con los siguientes encabezados: a) "SRC_BASE"; un nombre de material de laboratorio para "Cóctel de Base", b) "WELL_BASE"; así ubicaciones en el material de laboratorio para "Cóctel de Base", c) "VOL_BASE"; volumen de transferencia para "Cóctel de base" en l, d) "SRC_ACT"; un nombre de material de laboratorio para "Cóctel de activación", e) "WELL_ACT"; así ubicaciones en el material de laboratorio para "Cóctel de activación", f) "VOL_ACT"; volumen de transferencia para "Cóctel de activación" en l, g) "DEST_MACT"; información de la posición cubierta para el "Maestro de anticuerpos Cocktail", y h) "WELL_MACT"; así información de posición en el bastidor de tubo de "Cocktail Master Anticuerpo".
- Llene la información en virtud de las cabeceras creadas en 3.2.6) (Tabla 7) de la siguiente manera: a) utilizar "BASE_CT"bajo SRC_BASE, b) la información de ubicación lista bien para "WELL_BASE" como se muestra en la Figura 3A, c) la lista de volumen total de anticuerpos (25 l de tampón + suma de todos los títulos de anticuerpos de base para sola tinción) en "VOL_BASE", d) utilizar "ACT_CT" bajo SRC_ACT, e) lista bien información de ubicación para "WELL_BASE" como se muestra en la Figura 3B, f) lista volumen total de anticuerpos (25 l de tampón + suma de todos los títulos de anticuerpos de activación para una sola tinción) bajo "VOL_ACT". Transferencia de 25 l de tampón para T-Cell FM3. Consulte la Tabla 1 para las Pruebas 1-3, g) el empleo "SPL_TUBES_1" (ver 3.2.10) para "DEST_MACT", y h) lista bien información de ubicación para "WELL_MACT" como se muestra en la Figura 8.
Nota: Los siguientes pasos serán 3.2.8-3.2.15 programar el procedimiento de fabricación de "Cocktail Master Anticuerpo" - Abrir un nuevo método (Figura 7).
- Arrastre el "Instrmento icono Configuración "para el nuevo método (Figura 7).
- En el campo de especificación de "Configuración del instrumento", arrastrar iconos para las puntas de P1000, dos "SmallTuberack_microfugetubes", y "BiocisionCoolRack_XT" en el diagrama de la cubierta. Abrir el cuadro de diálogo de los dos "SmallTuberack_microfugetubes" y el nombre como "BASE_CT" y "ACT_CT", respectivamente, según se especifica en 3.1.17. Abrir el cuadro de diálogo de "BiocisionCoolRack_XT" y el nombre como "SPL_TUBES_1" como se especifica en 3.2.7 (Figura 9).
- Añadir un nuevo "Grupo" arrastrando un icono de "grupo" para el método (Figura 7).
- Arrastrar el icono "Transfer desde archivo" directamente debajo del icono "Grupo" para transferir "Cocktail base" para hacer "Cocktail Master Anticuerpo" (Figura 7).
- En el campo de especificación de "Transferencia De Archivo", seleccione la punta P1000 en uso, selegidos "descargarlos" cuando la transferencia se realiza, y comprobar "Cambie las puntas entre las transferencias".
- En el campo de especificación de "Transferencia De Archivo", seleccione el archivo "AB_MACT" (Tabla 7) por la navegación, marque "del archivo tiene una fila de cabecera". Seleccione "SRC_BASE" para la posición material de laboratorio de origen y "WELL_BASE" para obtener información bien en el material de laboratorio de origen, seleccione "DEST_MACT" para el material de laboratorio de destino y "WELL_MACT" para obtener información bien en el material de laboratorio de destino, y seleccione "VOL_BASE" para obtener información volumen (figura 10). Eligió la técnica de transferencia apropiada para las extremidades P1000.
Nota: LLS puede no ser necesario para este proceso. - Añadir otra "Transferencia desde archivo" arrastrándolo directamente debajo de "Grupo" para transferir el "Cóctel de activación" que se va a mezclar con el "Cóctel de base" para hacer "Maestro de anticuerpos Cocktail" (Figura 7 </ Strong>). Del mismo modo establecer la etapa de transferencia como en 3.2.13 y 3.2.14. Las excepciones son las siguientes: a) Seleccione "SRC_ACT" para la posición material de laboratorio de origen, b) "WELL_ACT" para obtener información bien en el material de laboratorio de origen, yc) "VOL_ACT" para obtener información volumen.
4. Procedimiento de operación
- En primer lugar, haga doble clic en el icono del software para iniciar el lector de código de barras 2D en el equipo.
- A continuación, haga doble clic en el icono del software para iniciar el manipulador de líquidos automatizado en el equipo.
- En "instrumento", seleccione "Inicio Todos los ejes" para jeringas principales del manipulador de líquidos automatizado. Asegúrese de que todas las jeringas no contienen burbujas de aire visibles.
Nota: "Inicio Todos los ejes" también dará al instrumento un punto de referencia desde el cual hacer movimientos posteriores. - Abra el método para hacer el "Cocktail Base" y el "Cóctel de activación" (Figura 2) en el software por unautomated manipulador de líquidos.
- Coloque los tubos de microcentrífuga en "SmallTuberack_microfugetubes" para "BASE_CT" y "ACT_CT", según el número de "Cocktail Base" y "Cocktail de activación" que deben efectuarse (Figura 3). Luego colocarlos en la cubierta de acuerdo con la "Configuración del instrumento" (Figura 5).
- Coloque el depósito con tampón en la cubierta de acuerdo con la "Configuración del instrumento".
- De-casquillo tubos de códigos de barras 2D que contienen los anticuerpos usando un destapador de 8 canales tapón de rosca. Mantenga las tapas en el orden exacto en una bandeja de explotación agrícola del casquillo con el fin de evitar la contaminación cruzada. Coloque el "Matrix_OneML_TubeRack" en la cubierta de acuerdo con la "Configuración del instrumento" (Figura 5).
- Consejos lugar P50 LLS filtrados, consejos filtrados P200 LLS, y consejos P1000 en la cubierta de acuerdo con la "Configuración del instrumento" (Figura 5).
- Iniciar el método haciendo clic en el tri verdeángulo en forma de icono de inicio. Como lo indica la ventana emergente, asegúrese de que todos los elementos de la cubierta se ajustan a la "Configuración del instrumento" como se define en el método. No coloque ningún objeto que no figuran en la "Configuración del instrumento" en la cubierta, ya que esto podría aplastar a la vaina y / o la pinza. Pulse el botón "OK" para continuar.
- Después de la "Matrix_OneML_TubeRack" se mueve sobre el lector de código de barras 2D y se leen los códigos de barras, otra ventana emergente le preguntará si todos los códigos de barras son leídos. Proceder con la tecla "OK" una vez confirmada.
- Una vez completada la transferencia por parte del manipulador de líquidos automatizado, vuelva a tapar los tubos con códigos de barras 2D utilizando un destapador de 8 canales tapa roscada y volver a ponerlos a 4 ° C.
- Vortex todos los tubos de microcentrífuga vigorosamente durante 20 segundos, y devolverlos en los bastidores de tubo.
Nota: Insuficiente agitación puede resultar en la tinción de las células subóptima. - Cierre el procedimiento de fabricación de "Cocktail Base" y "Cocktail de activación". A continuación, abra el método para la fabricación de "Cocktail Master Anticuerpo".
- Configurar 5 ml tubos de poliestireno de fondo redondo pre-etiquetados en el "BiocisionCoolRack_XT" (Figura 8) y colocarlo en la cubierta. Las etiquetas deben indicar qué "Cocktail Base" y "Cocktail de activación" se mezclan, así como la identificación del paciente apropiado.
- Colocar bastidores de tubos para "Cóctel de Base", "Cóctel de activación", y consejos P1000 en la cubierta (Figura 9). Iniciar el método (Figura 7). Como lo indica la ventana emergente, asegúrese de que los elementos de la instalación de la cubierta partido instrumental en el método (Figura 9). Pulse el botón "OK" para continuar.
- Cuando se realiza el proceso anterior, agregar manualmente 50 l de muestras de sangre en cada 5 ml de tubos de poliestireno de fondo redondo que contiene la mezcla de anticuerpos.
- tubos de muestra vórtice dentro de una cabina de seguridad biológica de clase II e incubar 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Takatención e evitando las rayas de sangre en los lados de los tubos, ya que esto dará como resultado la tinción inconsistente. Retire cuidadosamente cualquier mancha de sangre mediante hisopos de algodón humedecidos con tampón de lavado de flujo.
- Añadir 1 ml de tampón de lisis RBC manualmente e incubar 15 min a TA en la oscuridad.
- Añadir 2 ml de tampón de lavado de flujo (azida de sodio al 0,1%, 1% de BSA, 10 U / ml de heparina en 1X HBSS) y centrifugar durante 5 min a 400 x g. Desechar el sobrenadante en el interior de una cabina de seguridad biológica de clase II. Repita este proceso de lavado. Volver a suspender las células teñidas en 0,5 ml de tampón de lavado de flujo.
- Establecer un citómetro de flujo que está equipado con láseres de harina y filtros apropiados, así como muestras de ejecución utilizando tubos de 5 ml de poliestireno de fondo redondo. Utilizar métodos de calibración y compensación de fluorescencia citómetro estándar para la recopilación de datos 12,15. Recoger todos los parámetros enumerados en "fluoróforo" en la Tabla 1.
Nota: Los materiales de control apropiados se deben utilizar en cada ejecución para asegurar culo adecuadoay el rendimiento. - Después las muestras se ejecutan, exportar los datos adquiridos como archivos de FCS.
- Analizar los datos usando el software apropiado. Identificar subconjuntos de células T usando una estrategia compuerta esbozado por el Proyecto Human Immunology 1.
Representative Results
El objetivo de todo el inmunofenotipo de sangre es la obtención cuantitativa (la delineación de los subconjuntos de células inmunes) y la información cualitativa (detección de estado de activación) en las células inmunitarias. Hemos modificado ligeramente el panel immunophenotyping células T propuesto por el proyecto Human Immunology 1 a mejorar el rendimiento general de la aplicación de este método (Tabla 1). Nuestro panel de células T tiene como objetivo identificar, memoria naïve central (CM), memoria efectora (EM), y las células T efectoras. En pocas palabras, discriminamos dobletes basado en FCS-A y FCS-H. Luego puerta en los linfocitos en base a la dispersión lateral y los niveles de CD45. Las células T se identificaron entonces por la expresión de CD3. Células T CD3 + se diferencian en células T delta gamma y células T delta gamma. células T αβ se dividen adicionalmente en células T CD4 + y T CD8 +. Las células CD4 + y T CD8 + se analizan a continuación por sus subconjuntos basado en expression de CD45RA y CCR7: CD45RA - CCR7 + CM, CD45RA + CCR7 + vírgenes, CD45RA + CCR7 - efector, y CD45RA - CCR7 - las células T EM 1. Además, también monitorizamos su expresión de marcadores de activación tales como CD38, HLA-DR, ICOS, PD-1, GITR, el 4-1BB, CD69, NKG2D y OX40 para obtener información cualitativa.
Para demostrar la precisión de este método, teñidas muestras de sangre entera periférica de 4 donantes sanos 5 veces en un día. La figura 11 muestra la relación entre el porcentaje de subpoblaciones de linfocitos T en linfocitos seleccionados y ciento coeficiente de variación (% CV). Un desglose detallado de las subpoblaciones de células T ciento en linfocitos separados y% CV para cada subconjunto se muestra en la Tabla 8. Los datos de las pruebas 2 y 3 no están incluidos en la Figura 11 y la Tabla 8 para mayor simplicidad. Menos de 25% CVentre (precisión inter-ensayo) se ha sugerido para los criterios de aceptación para los ensayos de biomarcadores fenotípicas para su uso en investigación 10. Todas las medidas cumplen este criterio, excepto las células γδ ICOS + T (26,64 a 46,39%. Tabla 8) y células T CD8 + ICOS (14,64 a 58,39%. Tabla 8). Estos valores se muestran con fines de demostración. Nosotros no utilizamos estas medidas porque ICOS desempeña principalmente un papel importante en la activación de las células T CD4 16. La tendencia a una mayor CV% en las poblaciones que comprenden un bajo porcentaje de la población total fue observado por otros 7. En caso investigadores están interesados en el seguimiento de eventos raros-, el número de células examinó debe incrementarse con el fin de superar la mayor imprecisión 17. En conjunto, nuestros datos demuestran el éxito del despliegue de la automatización en la preparación de muestras de todo el inmunofenotipo de sangre.
< img alt = "Figura 1" src = "/ files / ftp_upload / 53485 / 53485fig1.jpg" />
Figura 1. Flujo de trabajo para determinar el inmunofenotipo de sangre entera periférica. Paso a paso de flujo de trabajo de ensayo inmufenotípico se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Descripción del método para la fabricación de "Cocktail Base" y "Cocktail de activación". Los pasos en el procedimiento de fabricación de "Cocktail Base" y "Cocktail de activación" en el software para el manipulador de líquidos automatizado se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
e 3 "src =" / files / ftp_upload / 53485 / 53485fig3.jpg "/>
Figura 3. Disposición para el bastidor tubo con BACE_CT y ACT_CT. (A) muestra la disposición para el soporte de tubos de "BACE_CT". (B) muestra la disposición para el soporte de tubos de "ACT_CT". Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Los aparatos de laboratorio para la definición de soporte para tubos con los tubos de códigos de barras 2D. Paso a paso el proceso de definición de la gradilla de tubos con tubos de códigos de barras 2D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
485fig5.jpg "/>
Figura 5. Configuración del instrumento para el método para la fabricación de "Cocktail Base" y "Cocktail de activación". Se muestra la disposición de la cubierta para el método para la fabricación de "Cocktail Base" y "Cocktail de activación". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Configuración de "Crear conjunto de datos". Se muestra la configuración detallada para "Crear conjunto de datos". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figu re 7. Descripción del método para la fabricación de "Cocktail Master Anticuerpo". Los pasos en el procedimiento de fabricación de "Cocktail Master de anticuerpos" en el software para el manipulador de líquidos automatizado se muestra. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Disposición para el soporte de tubos de 5 ml con tubos de poliestireno de fondo redondo. Se muestra la disposición para el soporte de tubos de "SPL_TUBES_1". FM3 significa fluorescencia menos 3 (violeta brillante 421, ficoeritrina, aloficocianina y). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
ftp_upload / 53485 / 53485fig9.jpg "/>
Figura 9. Configuración del instrumento para el método para la fabricación de "Cocktail Master Anticuerpo". Se muestra la disposición de la cubierta para el método para la fabricación de "Cocktail Master Anticuerpo". Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10. Configuración de "Transferencia desde archivo". Se muestra la configuración detallada para la "transferencia desde archivo". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11. Low vari la capacidad de la sangre entera immunophenotyping semiautomático. CV valores individuales de todas las poblaciones celulares analizadas a partir de cuatro donantes sanos se muestran como círculo abierto azul. curva de regresión se muestra en la línea azul. Rojo líneas de puntos indican el 95% confía en bandas y las líneas de puntos muestran la codicia 95% bandas de predicción. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12. Un ejemplo de tinción subóptima. La tinción se llevó a cabo con agitación adecuado o inadecuado de tubos de microcentrífuga de "BACE_CT" y "ACT_CT". Hay dos poblaciones cerradas en B. La población de menor importancia con una débil tinción CD45 representa células que no reciben tinción óptima.g12large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| GRUPO | MARCADOR | fluoróforo | Clon | TITULO (l / manchas) | |
| COCTEL DE BASE | TCell | CD45 | FITC | 2D1 | 0,4 |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 1 | ||
| CD8 | APC-H7 | SK1 | 0,4 | ||
| CD4 | PerCP-CY5.5 | SK3 | 2 | ||
| CCR7 | PE-CF594 | 150503 | 1 | ||
| CD45RA | PE-Cy7 | L48 | 1 | ||
| TCRab | BV786 </ Td> | T10B9.1A-31 | 1 | ||
| TCRgd | BV650 | B1 | 5 | ||
| ACTIVACIÓN Cocktail-1 | PRUEBA1 | HLA-DR | BV421 | G46-6 | 5 |
| CD278 (ICOS) | EDUCACIÓN FÍSICA | DX29 | 5 | ||
| CD38 | APC | HB7 | 1 | ||
| ACTIVACIÓN Cocktail-2 | TEST2 | CD279 (PD1) | BV421 | EH12.1 | 2.5 |
| CD357 (GITR) | EDUCACIÓN FÍSICA | eBioAITR | 5 | ||
| CD137 (41BB) | APC | 4B4-1 | 10 | ||
| ACTIVACIÓN Cocktail-3 | TEST3 | CD69 | BV421 | FN50 | 1 </ Td> |
| CD314 (NKG2D) | EDUCACIÓN FÍSICA | 1D11 | 2 | ||
| CD134 (OX40) | APC | ACT35 | 5 |
Tabla 1. Una lista de anticuerpo para el panel de células T modificadas.
| AB | antes de Cristo |
| CD45_FITC | 0163562388 |
| CD3_Alexa700 | 0163562110 |
| CD4_PerCP_CY5.5 | 0163562364 |
| CD8_APC-H7 | 0163562363 |
| CCR7_PE-CF594 | 0163562387 |
| CD45RA_PE-Cy7 | 0163562091 |
| TCRab_BV786 | 0163562069 |
| TCRgd_BV650 | 0163562108 |
| 0163562339 | |
| A_CD278 (ICOS) _PE | 0163562082 |
| A_CD38_APC | 0163562317 |
| A_CD279 (PD1) _BV421 | 0163562340 |
| A_CD357 (GITR) _PE | 0163562093 |
| A_CD137 (41BB) _APC | 0163562315 |
| A_CD69_BV421 | 0163562341 |
| A_CD314 (NKG2D) _PE | 0163562314 |
| A_CD134 (OX40) _APC | 0163562316 |
Tabla 2. Nombres de anticuerpos con los números de código de barras 2D.
| GRUPO | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCell | 1 | 7.2 | |
| TCell | 1 | CD45_FITC | 7.2 |
| TCell | 1 | CD3_Alexa700 | 18 |
| TCell | 1 | CCR7_PE-CF594 | 18 |
| TCell | 1 | CD45RA_PE-Cy7 | 18 |
| TCell | 1 | TCRab_BV786 | 18 |
Tabla 3. Un archivo "BASE_CT_P50": nombres de anticuerpos y la información de volumen.
| GRUPO | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCell 1 | CD4_PerCP_CY5.5 | 36 | |
| TCell | 1 | TCRgd_BV650 | 90 |
Tabla 4. Un archivo "BASE_CT_P200": nombres de anticuerpos y la información de volumen.
| GRUPO | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| PRUEBA1 | 7 | A_HLA-DR_BV421 | 30 |
| PRUEBA1 | 7 | A_CD278 (ICOS) _PE | 30 |
| PRUEBA1 | 7 | A_CD38_APC | 6 |
| TEST2 | 13 | A_CD279 (PD1) _BV421 | 15 |
| TEST2 | 13 | A_CD357 (GITR) _PE | 30 |
| TEST3 | 19 | A_CD314 (NKG2D) _PE | 12 |
| TEST3 | 19 | A_CD69_BV421 | 6 |
| TEST3 | 19 | A_CD134 (OX40) _APC | 30 |
Tabla 5. Un archivo "ACT_ CT_P50": nombres de anticuerpos y la información del volumen.
| GRUPO | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST2 | 13 | A_CD137 (41BB) _APC | 60 |
Tabla 6. Un archivo "ACT_CT _P200": nombres de anticuerpos y la información del volumen.
| DONANTE# | SRC_ BASE | COCTEL DE BASE | BIEN_ BASE | VOL_ BASE | SRC_ACT | dades VACIÓN CÓCTEL | BIEN_ ACTO | VOL_ACT | DEST_MACT | BIEN_ MACT | |
| HD001 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 1 | ||
| HD001 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | PRUEBA1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 7 | |
| HD001 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 13 | |
| HD001 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 19 | |
| HD002 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 2 | |
| HD002 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | PRUEBA1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 8 | ||
| HD002 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 14 | |
| HD002 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 20 | |
| HD003 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 3 | |
| HD003 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | PRUEBA1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 9 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | 15 |
| HD003 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 21 | |
| HD004 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 4 | |
| HD004 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | PRUEBA1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 10 | |
| HD004 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 13 | 42.5 | SPL_TUBES_1 | dieciséis | ||
| HD004 | BASE_CT | TCell | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 22 | |
Tabla 7. Un archivo "AB_MACT": fuente y destino de la información "Cocktail Master Anticuerpo".
| Población # en la Fig. 1 | yo | ii | iii | iv | v | |
| nombre de la población | CD3 + | células T ab | células T gd | CD3 + CD4 + | CD3 + CD8 + | |
| % De los linfocitos </ Td> | Heathly donante # 1 | 79.80 | 75.20 | 2.70 | 49.60 | 22.30 |
| Heathly donante # 2 | 69.40 | 61.90 | 5.85 | 44.40 | 16.20 | |
| Heathly donante # 3 | 75.80 | 69.60 | 4.75 | 42.00 | 23.50 | |
| Heathly donante # 4 | 77.20 | 73.50 | 1.98 | 52.70 | 18.90 | |
| %CV | Heathly donante # 1 | 1.42 | 1.58 | 3.70 | 2.50 | 1.56 |
| Heathly donante # 2 | 2.48 | 2.39 | 5.74 | 2.82 | 2.41 | |
| Heathly donante # 3 | 1.15 | 1.40 | 6.32 | 1.42 | 2.72 | |
| Heathly donante # 4 | 0,81 | 0.94 | 5.45 | 1.20 | 1.44 | |
| Promedio | 1.47 | 1.58 | 5.30 | 1.99 | 2.03 | |
| La desviación estándar | 0,72 | 0.61 | 1.13 | 0,79 | 0.63 |
Tabla 8. Los datos en bruto para% de linfocitos y% CV para cada subconjunto representados gráficamente en la figura 4. Obsérvese que los datos para las pruebas 2 y 3 no se muestran en la Figura 5 y la Tabla 8 para simplificar la presentación de datos.
Discussion
Fenotipo inmune de sangre periférica es de importancia crítica para la promoción de conocimientos sobre las respuestas individuales a la inmunoterapia. El desafío consiste en la normalización de ensayo para el control de experimento a experimento 1,14 variabilidad. Una fuente principal de variabilidad reside en la manipulación humana de las muestras. Por lo tanto, es concebible que la automatización parcial o total de procesamiento de la muestra facilitará una dramática reducción en la variabilidad 1,14-experimento a experimento. En este protocolo, nos informan de nuestro esfuerzo exitoso para reducir al mínimo la variabilidad del ensayo mediante la introducción de un manipulador de líquidos automatizado equipado con lector de código de barras 2D para la tinción de muestras de sangre en todo el inmunofenotipo.
En el diseño, la aplicación de este método es muy versátil y puede supervisar otros subconjuntos inmunes adicionales mediante la adición de "cócteles Base" para definirlos. Tales subconjuntos incluyen células T auxiliares, células reguladoras T, células B, células NK, células dendríticas, y monocitos (manuscrito enpreparación) 18. Hemos adaptado paneles de anticuerpos recomendados por el consorcio mediante la introducción de marcadores adicionales 1. Las poblaciones celulares se identificaron utilizando "Cocktail Base" conjugado con fluorocromos con emisiones mínima en el brillante violeta 421 (BV421), ficoeritrina (PE), y aloficocianina (APC) detectores, ya que queríamos reservar estos canales para la detección de antígenos inducibles. Esta característica no sólo asegura la más alta sensibilidad para monitorizar el estado de activación de las células inmunes sino que también permite un alojamiento flexible de nuevos marcadores de activación como estos tres fluorocromos están más frecuentemente conjugarse con anticuerpos contra marcadores inducibles. Por lo tanto, nuestro método no sólo es adecuado para la preparación de cócteles para toda inmunofenotipo de sangre, pero también es útil para la tinción de otras muestras, incluyendo las células mononucleares de sangre periférica y células recuperadas a partir de tejidos desglosados (por ejemplo, tumor).
introducción exitosaproducción de nuestro método requiere una atención especial a los pasos en la preparación de material de laboratorio, y la programación y la ejecución del método. Preparación de los tubos de códigos de barras 2D incluye etiquetado con etiquetas legible por humanos y la transferencia de los anticuerpos a los tubos designados. Para evitar la introducción de errores, se recomienda hacer esto con dos personas. Siempre que el cambio de hojas de cálculo, los investigadores deben verificar si el método funciona correctamente. La elección de los métodos de pipeteo adecuadas durante la programación asegura la transferencia de líquido éxito. LLS permite pipeteo sin que los desechos se precipitó desde el fondo de los tubos de anticuerpos, para los que usamos ya sea P50 o P200 puntas conductoras. LLS puede no ser una buena opción para las extremidades P1000 como LLS es más sensible con puntas P1000 y, a veces falsamente provocada por la presencia de burbujas. Heights en la definición de material de laboratorio deben ajustarse para cada instrumento podría ocurrir la transferencia de líquido como subóptima, por ejemplo, si no hay suficiente espacio entre el borde de las puntasy la parte inferior de los tubos. Como se muestra en la Figura 12, si el "Cocktail Base" y / o "Cóctel de activación" No se agitaron bien, esto puede resultar en manchas subóptima.
Pensamos sobre el uso de los reactivos liofilizados para la tinción de células como un enfoque alternativo para reducir la variabilidad relacionada con la dispensación de reactivo 19. Sin embargo, se conocen conjugados poliméricos de tintes violetas brillantes para interactuar unas con otras señales no específicas que causan. Como tal, la adición de más de dos conjugados poliméricos (por ejemplo, BV421 y BV650, etc.) en los reactivos liofilizados pueden causar la señalización no específica (por ejemplo, aumento de la señal de fondo BV650 en BV421 + población) 20. Por otra parte, los reactivos liofilizados carecen de flexibilidad para la inclusión de nuevas manchas. Por lo general son más caros y requieren una orden a granel. Por estas razones, se optó por utilizar el manipulador de líquidos automatizado equipado con los tubos de códigos de barras 2D. A pesar de que tcopos de tiempo para configurar y conlleva una inversión inicial para comprar el instrumento, a la larga, serán compensados por factores tales por el aumento de la productividad y la reproducibilidad de los ensayos. De hecho, algunos grupos se informó anteriormente la integración exitosa del manipulador de líquidos automatizado en su flujo de trabajo de immunophenotyping o aplicaciones similares 21,22. soluciones automatizadas para el análisis de citometría de flujo también están disponibles a partir de fuentes comerciales (FACS SPA III, Cóctel de preparación automática de estaciones de trabajo, y FlowStainer). Esto indica además que hay una gran necesidad para la preparación de cócteles automatizado para determinar el inmunofenotipo.
Después de dominar esta técnica, prevemos que el desarrollo de totalmente automatizado immunophenotyping sangre entera reducirá aún más la variabilidad del experimento a experimento y podría hacer que toda la sangre immunophenotyping factible, incluso en un entorno de 23 ensayo clínico multicéntrico. Ya hemos comenzado a utilizar un Lyse erah asistente para automatizar los pasos de lisis y lavado. también Prevemos que la determinación automatizada del volumen de anticuerpo en los tubos de códigos de barras 2D y el seguimiento de dispensación de reactivo mejorará en gran medida el inventario de anticuerpos y el control de calidad de nuestro método, respectivamente.
Disclosures
YK, ILG, TLM, WLM, DPH, y KSB: intereses financieros en competencia. ANT es un empleado de Beckman Coulter, Inc. La publicación de este artículo de vídeo está patrocinado por Beckman Coulter, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 ml Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12 x 24 INCHES RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 ml Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1,025 µl | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µl (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10x Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1x, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
References
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O'Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S.
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
- BD biosciences. Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
