Évaluation de Planar-Cell-polarité phénotypes dans ciliopathie souris mutante cochlée
Summary
Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
Abstract
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
Introduction
cils primaires sont des appendices en fonction de microtubules longues qui se prolongent à partir de la surface de la plupart des cellules de mammifères. cils primaires sont souvent confondus avec des cils mobiles, dont il existe toujours multiples par cellule, et dont le but est de déplacer le fluide à travers les surfaces de la membrane. cils primaires, en revanche, adopter des rôles sensoriels et sont par conséquent également désignée comme les cils sensorielle. Une fois oublié depuis longtemps, cet organite a récemment été "redécouvert" en raison de son association avec une multitude de maladies génétiques humaines 1. Idéalement positionné comme un organite de signalisation, le cil primaire a été montré pour réguler de nombreuses voies de signalisation, dont beaucoup sont importantes non seulement dans l'homéostasie tissulaire et les maladies, mais également au cours du développement 2.
L'une des premières voies de signalisation est prouvé qu'ils sont associés à un dysfonctionnement des cils est la voie de signalisation Wnt non canonique, connu également que la polarité cellulaire planaire (PCP) voie <sup > 3. Cette cascade de signalisation initialement identifié chez la drosophile, est essentiel pour l'embryogenèse; en particulier pour les processus de convergence et d'extension et pour l'orientation correcte de cellules dans le plan de l'épithélium 4. La signalisation séquentielle d'un ensemble de base de protéines régulatrices traduit indications directionnelles qui conduisent finalement à des réarrangements du cytosquelette et se traduisent par la polarisation coordonnée des cellules épithéliales dans un plan 5. Le processus de convergence et l'extension est absolument nécessaire pour le canal cochléaire pour allonger et de structuration cellulaire correcte 6. Comme il est régulée par activation de la voie de PCP, l'un des phénotypes les plus frappants de mutants PCP cochlée est un canal cochléaire raccourci avec l'épithélium sensoriel désorganisé 7. De même, les mutants de souris, qui manquent de cils, présentent également une telle convergence et l'extension phénotype 8,9, mais précisément comment cela est réglementé reste à élucider.
ve_content "> Parce que les processus de convergence et de vulgarisation sont essentiels pour l'excroissance du canal cochléaire, et la structuration cellulaire de l'épithélium sensoriel dans le canal cochléaire, le développement de la cochlée est un organe idéal pour examiner la signalisation PCP au cours du développement des vertébrés. L'organe de Corti, le terme donné à l'épithélium sensoriel spécialisé qui tapisse le canal cochléaire, est composé de cellules de soutien non-sensorielles et les cellules ciliées mécano qui doivent être uniformément orientés pour la cochlée pour fonctionner 10. les cellules ciliées mécano sont appelés ainsi en raison de la faisceaux stéréocils qui se prolongent à partir de la plaque cuticulaire (de surface apicale) de chaque cellule sensorielle de cheveux 11. Ceux-ci agissent comme des transducteurs primaires de mécanosensibilité et en dépit de leur nomenclature comme stereocilia, sont en fait constituées de microvillosités sur la base de filaments d'actine modifié. de chaque poil en forme de chevron bundle, trois rangées de stéréocils sont organisées dans un pa très ordonnée et régulièrettern dans un cas comme manière d'escalier. Réel cils base microtubules, kinocilia appelés, sont nécessaires pour le développement et l'orientation des faisceaux stéréocils 12. A chaque cellule de cheveux, un seul kinocil est physiquement attaché à la touffe ciliaire, adjacent au centre de la rangée la plus haute des stéréocils. La fonction précise de la kinocil est pas claire, et une hypothèse est que le kinocil 'tire' stéréocils en forme à leur échéance de microvillosités 12. Chez les vertébrés, kinocilia dans la cochlée ne sont présentes que de façon transitoire et se rétractent à partir des cellules ciliées chez les souris avant le début de l'audition 11,13,14.Perte complète de cils dans les résultats de la cochlée en développement dans les conduits cochléaires sévèrement raccourcies, mal formée et mal orienté paquets stéréocils, ainsi que mis-positionnés organes de base 8,9. Un cil fonctionnelle est non seulement composé de l'axonème ciliaire. Beaucoup de protéines associées aux cilsfonction se produire dans des complexes localisés dans les sous-domaines connexes cils tels que le corps de base, zone de transition, ou ciliaire axonème 15. Le corps de base, provenant de la centriole mère du centrosome, est également un centre de microtubules organisation pour les microtubules étendant depuis le cil dans le corps cellulaire et peut réguler le trafic intracellulaire, ainsi que le trafic de ciliaire. La zone de transition ciliaire est une autre région où la fonction ciliaire est réglementé en termes d'organisation importation et l'exportation de composés ciliaires 16.
De multiples études ont identifié un lien entre les cils et Wnt non canonique (signalisation PCP), bien que le mécanisme précis est difficile 17. Redondance de gènes ciliaires et le PCP et la sensibilité de la polarité cellulaire à des anomalies cellulaires généralisées, il est difficile de relier directement une mutation à des déficits spécifiques PCP. L'une des sorties de lecture de la signalisation de PCP est le positionnement du corps de base et primary cil donc séparer le primaire à partir des défauts secondaires est difficile. Certaines études de mutants de poisson zèbre et la souris ont suggéré aucun lien entre les cils et de signalisation Wnt 18-20. Les écarts dans les données peuvent refléter des espèces, des tissus ou des différences temporelles dépendantes des cotisations ciliaires vers la signalisation Wnt. En outre, la réactivité Wnt normale pourrait être retenue si les organes de base restent fonctionnelles. Une connaissance plus approfondie le rôle des protéines ciliaires dans les voies de signalisation cellulaire et d'autres phénomènes biologiques est cruciale pour notre compréhension de la biologie cellulaire et du développement, ainsi que pour le développement de stratégies thérapeutiques ciblées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lors de la préparation des tissus cochléaire pour l'analyse, il y a quelques points clés à garder à l'esprit. Tout d'abord, les différences de fond génétique peuvent modifier le phénotype cochléaire, ce qui rend nécessaire d'analyser et de comparer les seuls contrôles même portée. Deuxièmement, l'élimination complète de la membrane de Corti est nécessaire pour obtenir les meilleures images avec immunohistochimie et est essentielle pour SEM. La membrane de Corti est une structure opa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'auteur tient à remercier Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer et Zoe Mann et pour leur évaluation critique du manuscrit. Ce travail a été financé par le Prix Sofja Kovalevskaya (Fondation Humbodlt) et de l'Université Johannes-Gutenberg, Mainz, Allemagne.
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
| Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
| Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
| Dissecting microscope. | Various | ||
| Uncoated glass microscope slides | Various | ||
| Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
| Transfer pipettes | Various | ||
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
| Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
| PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
| Fluorescent Microscope | Various | ||
| Critical Point Dryer | Various | ||
| Scanning Electron Microscope | Various | ||
| Glass microscope slides | Various | ||
| Glass coverslips | Various | ||
| Kimwipe Tissue | Various | ||
| Fine Paint Brush | |||
| Reagents | |||
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
| Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
| 2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
| NaCl | Various | ||
| CaCl 2 | Various | ||
| Triton X-100 | Various | ||
| Normal Goat Serum | Various | ||
| AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
| Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
| Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Ethanol 200 proof | Various | ||
| Antibodies | |||
| anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
| anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
| anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
| anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
| Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
| Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
| anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
| anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
| Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
| Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |
References
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