Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
Birincil kirpikler birçok memeli hücre yüzeyinden uzanan uzun bir mikrotübül göre uzantıları vardır. Birincil kirpikler sıklıkla hangi zaman hücre başına birden fazla var, hareketli kirpikler ile karıştırılmamalıdır ve Amacı membran yüzeyleri boyunca sıvıyı taşımak için vardır. Birincil sil, aksine, duyu rol kabul eder ve buna bağlı olarak aynı zamanda, duyusal kirpikler adlandırılır. Bir kez çoktan unutulmuş, bu organel son zamanlarda insan genetik hastalıklar 1 çok sayıda ile dernek sonucunda 'yeniden keşfedilen' olmuştur. İdeal bir sinyal organel olarak konumlandırılmış, birincil kirpik sayısız sinyal doku homeostazında ve hastalık değil, sadece önemli olan birçok yollar, aynı zamanda gelişim 2 sırasında düzenleyen gösterilmiştir.
kirpikler fonksiyon bozukluğu ile bağlantılı olduğu gösterilmiştir birinci sinyal yollarının bir düzlemsel hücre polarite (PCP) yol olarak da bilinen standart olmayan Wnt oldu <sup > 3. Başlangıçta Drosophila tanımlanan bu sinyal çağlayan, embriyogenez için kritik öneme sahiptir; yakınsama ve uzatma işlemleri için özellikle ve epitel 4 düzleminde hücrelerin doğru yönlendirmesi için. Düzenleyici proteinler kümesi çekirdeğin sıralı sinyal sonuçta hücre iskeleti düzenlenmeleri yol açabilir ve bir düzlemde 5 epitel hücrelerinin koordine polarizasyon neden yönlü ipuçları çevirir. Yakınsama ve uzatma işlemi kesinlikle uzamasına koklear kanal ve doğru hücresel desenlendirme 6 için gereklidir. Bu PCP yolunun aktivasyonu yoluyla düzenlenir olarak, koklea PCP mutantlar en çarpıcı fenotipleri bir dağınık duyusal epitel 7 kısaltılmış koklear kanal olduğunu. Düzenlenir bu aydınlatılamamıştır gerekmektedir tam olarak nasıl olsa Benzer şekilde, aynı zamanda, kirpikler eksikliği fare mutantlar, böyle bir yakınsama ve uzatma fenotip 8,9 sergilerler.
yakınsama ve uzatma işlemleri koklear kanalın akıbet ve koklear kanal içinde duyusal epitel hücre desenlendirme için kritik olduğundan ve_content ">, gelişmekte olan koklea omurgalı gelişimi sırasında PCP sinyalizasyon incelemek için ideal bir organdır. organı Corti, koklear kanal, muntazam 10 çalışması kokleadaki için yönelik olmalıdır olmayan duyu destek hücreleri ve mechanosensory saç hücrelerinin oluşur hatları uzman duyusal epiteline verilen terim. mechanosensory saç hücreleri yani çünkü denir cuticular plaka uzanan stereociliary demetleri her duyusal saç hücre 11 (apikal yüzeyi). mechanosensation ve stereocilia olarak adlandırılması rağmen birincil dönüştürücüler gibi bu hareket, aslında modifiye aktin filament esaslı mikrovilluslar oluşmaktadır. her zikzak şeklinde saçlar içinde demet, stereocilia üç satır bir çok sipariş edilen ve düzenli pa düzenlenirBir merdiven durumda benzeri şekilde ttern. Gerçek mikrotübül göre sil, olarak adlandırılan kinocilia, stereociliary demetlerin 12 geliştirilmesi ve yönlendirme için gereklidir. her hücre üzerine tek kinocilium fiziksel stereocilia uzun satıra merkezi bitişik olarak bulunur stereocilia demetine takılır. Kinocilium kesin işlevi belirsizdir ve bir hipotez onlar mikrovillus 12 olgun olarak kinocilium şekle stereocilia 'çeker' olmasıdır. Omurgalılarda, koklea kinocilia geçici de yer alır ve 11,13,14 işitme başlangıcından önce farelerde saç hücrelerden geri.Ciddi kısaltılmış koklear kanallarda gelişen koklea sonuçlarında kirpikler tamamen kaybedilmesi yanlış oluşmuş ve stereociliary demetleri yanı sıra yanlış yerleştirilmiş bazal organları 8,9 mis odaklı. Fonksiyonel kirpik sadece siliyer aksonem oluşan değildir. cilia ile ilgili birçok proteinfonksiyonu, bazal vücut geçiş bölgesi ya da silier aksonem 15 olarak kirpikler-ilişkili alt etki alanları lokalize kompleksleri meydana gelir. sentrozom annesi centriole türetilen bazal vücut, hücre vücuda uzak cilium uzanan mikrotübüller için mikrotübül organize merkezidir ve hücre içi ticaretini yanı sıra siliyer ticaretini düzenleyen. Siliyer geçiş zonu siliyer fonksiyon siliyer bileşiklerinin 16 ithalat ve ihracat organize bakımından düzenlenmiştir başka bölgedir.
Kesin mekanizması 17 belirsiz olmasına rağmen birçok çalışma, kirpikler ve kurallı olmayan Wnt (PCP sinyal) arasında bir bağlantı tespit ettik. Silier ve PCP genlerinin yedekleme ve genelleştirilmiş hücresel anormallikler hücre polarite duyarlılığı, zor doğrudan PCP özgü açıkları bir mutasyon bağlantı yapmak. PCP sinyalizasyon okuma çıkışları biri bazal vücut ve Primar konumlandırma olduğunuy kirpik, bu nedenle ikincil kusurları birincil yavru zordur. Zebra balığı ve fare mutantlar Bazı çalışmalar 18-20 sinyalizasyon kirpikler ve Wnt arasında bir bağlantı olduğunu ileri sürmüştür. verilerdeki Farklılıklar türler, doku ya da Wnt sinyal yolunda siliyer katkıları temporal bağımlı farklılıkları yansıtıyor olabilir. bazal organları işlevsel kalır Ayrıca, eğer normal bir Wnt yanıt muhafaza edilebilir. hücresel sinyal yolları ve diğer biyolojik olayların içinde siliyer proteinlerinin rolü daha derin bir anlayış bizim hücresel ve gelişimsel biyoloji anlayışı yanı sıra hedeflenen tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için için çok önemlidir.
analiz için koklear doku hazırlanırken, akılda tutulması gereken birkaç önemli nokta vardır. Birincisi, genetik arka planda farklılıklar gerekli analiz ve tek yavru kontrollerle karşılaştırılması hale koklear fenotip değiştirebilirsiniz. İkincisi, örtü oluşturan zarın tam olarak çıkarılması immünhistokimya ile en iyi görüntü elde etmek için gerekli ve SEM için gereklidir edilir. örtü oluşturan zar opak bir yapıdır ve görüntüleme daha zorlu hale altındaki doğrudan duyusal epitel…
The authors have nothing to disclose.
Yazar yazının eleştirel değerlendirilmesi için Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer ve Zoe Mann teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sofja Kovalevskaya Ödülü (Humbodlt Vakfı) ve Johannes-Gutenberg Üniversitesi, Mainz, Almanya tarafından finanse edildi.
Tools/Equipment | |||
Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
Dissecting microscope. | Various | ||
Uncoated glass microscope slides | Various | ||
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
Transfer pipettes | Various | ||
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
Fluorescent Microscope | Various | ||
Critical Point Dryer | Various | ||
Scanning Electron Microscope | Various | ||
Glass microscope slides | Various | ||
Glass coverslips | Various | ||
Kimwipe Tissue | Various | ||
Fine Paint Brush | |||
Reagents | |||
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
NaCl | Various | ||
CaCl 2 | Various | ||
Triton X-100 | Various | ||
Normal Goat Serum | Various | ||
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Ethanol 200 proof | Various | ||
Antibodies | |||
anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |